Els pesticides tenen un paper fonamental en la lluita contra l'escassetat d'aliments a nivell mundial i la lluita contra les malalties humanes transmeses per vectors. Tanmateix, el creixent problema de la resistència als pesticides requereix urgentment el descobriment de nous compostos que es dirigeixin a objectius infrautilitzats. Els canals del potencial receptor transitori d'insectes (TRPV), Nanzhong (Nan) i inactius (Iav), poden formar canals heteròlegs (Nan-Iav) i localitzar-se en òrgans mecanosensorials que intervenen en el geotropisme, l'oïda i la propiocepció en insectes. Alguns pesticides, com l'afidopirrolidona (AP), es dirigeixen a Nan-Iav a través de mecanismes desconeguts. L'AP és eficaç contra els insectes que punxen i xuclen (hemípters), i impedeix que s'alimentin interrompent la funció dels filaments. L'AP només es pot unir a Nan, però només Nan-Iav pot interactuar amb agonistes, inclosa la nicotinamida endògena (NAM), mostrant així activitat de canal. Malgrat el potencial de Nan-Iav com a objectiu insecticida, se sap poc sobre el seu muntatge de canals, els llocs d'unió reguladors i la regulació dependent de Ca2+, cosa que dificulta el desenvolupament posterior d'insecticides. En aquest estudi, es va utilitzar criomicroscòpia electrònica per determinar l'estructura de Nan-Iav en insectes Hemiptera en estat lliure de lligand calmodulina, així com amb AP i NAM al límit del domini citoplasmàtic de repetició d'anquirina (ARD). Sorprenentment, vam descobrir que la proteïna Nan en si mateixa pot formar un pentàmer, que s'estabilitza mitjançant interaccions ARD mediades per AP. Aquest estudi revela interaccions moleculars entre insecticides i agonistes i Nan-Iav, destacant la importància de l'ARD en la funció i l'acoblament del canal, i explorant el mecanisme de regulació del Ca2+.
En el context d'un canvi climàtic global cada cop més greu, el deteriorament de la seguretat alimentària mundial és un dels principals reptes del segle XXI, amb conseqüències en cascada per a la societat.1,2L'informe sobre l'estat de la seguretat alimentària i la nutrició al món 2023 (SOFI) de l'Organització Mundial de la Salut estima que aproximadament 2.330 milions de persones a tot el món pateixen inseguretat alimentària moderada a greu, un problema de llarga durada.3,4Malauradament, s'estima que entre un 20% i un 30% o més del rendiment dels cultius es perd anualment a causa de plagues i patògens, i s'espera que l'escalfament global agreugi la resistència a les plagues i la vulnerabilitat dels cultius.4, 5, 6, 7, 8El desenvolupament de pesticides és fonamental no només per protegir els cultius de les plagues i reduir la propagació de patògens transmesos per vectors, sinó també per combatre malalties humanes transmeses per vectors com el dengue, la malària i la malaltia de Chagas, que són cada cop més resistents als pesticides.5,9,10,11
Entre els principals objectius dels insecticides neurotòxics, el canal heterotetramèric TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) representa una classe d'objectius insecticides descoberts només en l'última dècada, inclosos insecticides disponibles comercialment com l'imidacloprid i la piraclostrobina.12, 13, 14L'insecticida semisintètic aphidopyrrolifen (AP) és un producte recentment desenvolupat i comercialitzat, el component principal del qual és l'insecticida actiu Inscalis®, que s'uneix a l'AP a un nivell d'activitat subnanomolar.15L'AP presenta una baixa toxicitat aguda per als pol·linitzadors, insectes beneficiosos i altres organismes no objectiu, i quan s'utilitza segons les instruccions de l'etiqueta, pot reduir la pressió de resistència a altres insecticides.16,17,18Nan i Iav estan àmpliament distribuïts entre espècies d'insectes, s'expressen conjuntament només en neurones receptores d'estirament cordal de les antenes i les extremitats, i són fonamentals per a l'oïda, la percepció de la gravetat i la propiocepció.13, 16, 19, 20, 21, 22L'AP, l'imidacloprid i la piraclostrobina estimulen el complex Nan-Iav a través d'un mecanisme únic, inhibint finalment la transducció del senyal propioceptiu.13,16,23En els insectes perforadors i xucladors (hemípters), com ara els pugons i les mosques blanques, la pèrdua de la propiocepció afecta la seva capacitat d'alimentació, cosa que finalment provoca la mort.13,24Curiosament, l'AP presenta una alta afinitat pel complex Nan-Iav i una baixa afinitat per Nan sol. La unió de l'AP al Nan-Iav indueix un corrent elèctric, però la unió al Nan sol no estimula l'activitat del canal. L'Iav en si no s'uneix a l'AP en absolut.16Això suggereix que Nan i Iav poden unir-se per formar diferents complexos de canals Nan-Iav (per exemple, amb diferents relacions estequiomètriques o diferents disposicions dins de la mateixa relació estequiomètrica) o que AP pot unir-se a múltiples llocs. A més, l'agonista natural nicotinamida (NAM) s'uneix a Drosophila Nan-Iav amb afinitat micromolar, exhibint efectes similars als dels pugons (AP) in vitro.16,25i inhibint la reproducció i l'alimentació dels pugons, cosa que finalment provoca la seva mort25,26Aquestes dades plantegen moltes preguntes. Per exemple, no està clar com es forma l'heterodímer Nan-Iav, quins llocs d'unió s'utilitzen per modular petites molècules i com aquestes petites molècules regulen la funció del canal suprimint la propiocepció. A més, no estan clares les raons per les quals la Nan en si és inactiva i té baixa afinitat per l'AP, mentre que l'heterodímer Nan-Iav és actiu i s'uneix a l'AP amb una afinitat més alta. Finalment, se sap poc sobre la regulació dependent del Ca2+ de la funció Nan-Iav i com s'integra en els processos de senyalització neuronal.13,21
En aquest estudi, combinant criomicroscòpia electrònica, electrofisiologia i tècniques d'unió de radiolligands, vam elucidar l'acoblament de Nan-Iav i el mecanisme de la seva unió a reguladors de petites molècules. A més, vam detectar calmodulina (CaM) unida constitutivament a Iav i pentàmers Nan estabilitzats amb AP. Aquests resultats proporcionen informació important sobre la regulació dels ions de calci en els canals, l'acoblament de canals i els factors que determinen l'afinitat d'unió al lligand. Més important encara, vam confirmar que l'ARD juga un paper central en aquests processos. El nostre estudi de canals d'insectes complets units a pesticides agrícoles rellevants27, 28, 29obre perspectives per al desenvolupament de la indústria de pesticides, millorant l'eficàcia i l'especificitat dels pesticides i permetent l'aplicació de compostos dirigits al TRPV a altres espècies per abordar la seguretat alimentària mundial i la propagació de malalties transmeses per vectors.
També vam trobar que Nan-Iav està regulat per Ca2+, i el mecanisme de regulació està mediat per CaM unit constitutivament. És important destacar que aquesta regulació dependent de Ca2+ de Nav per CaM difereix significativament dels mecanismes de regulació d'altres canals iònics (per exemple, canals de Na+ controlats per voltatge i canals TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57Al canal Nav1.2, el domini C-terminal de CaM s'associa hèlicoïdalment amb el domini C-terminal (CTD), i Ca2+ indueix la unió del seu domini N-terminal a la porció distal del CTD.56Al canal TRPV5/6, el domini C-terminal de CaM s'uneix a CTH, i Ca2+ indueix l'extensió ascendent del seu domini N-terminal dins del porus, bloquejant així la permeabilitat dels cations.53,54Proposem un model per a la funció regulada per Ca2+ de Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). En aquest model, el domini N-terminal de CaM s'uneix constitutivament al domini C-terminal (CTH) de Iav. En estat de repòs (baixa concentració de [Ca2+]), el domini C-terminal de CaM interactua amb Nan, estabilitzant la conformació ARD i promovent així l'obertura del canal. La unió d'un agonista/insecticida al canal indueix l'obertura dels porus, cosa que porta a l'afluència de Ca2+. El Ca2+ s'uneix aleshores a CaM, provocant la dissociació del domini C-terminal de l'ARD de Nan. Com que el bloqueig de la unió de CaM essencialment aboleix l'efecte inhibidor del Ca2+, aquesta dissociació modula la mobilitat de l'ARD, provocant així una inhibició o dessensibilització dependent de Ca2+. La ràpida recuperació dels corrents del canal després de l'elució d'ions de calci (Fig. 4g) suggereix que aquest mecanisme facilita respostes ràpides als senyals neuronals mediats per Ca2+. A més, s'ha informat que la regió C-terminal d'Iav, que encara no es coneix bé, juga altres funcions en la selecció de canals i la regulació actual.21
Finalment, el nostre estudi presenta l'estructura d'alta resolució d'un complex de canals TRP insecticida-insecticida d'importància agrícola, un descobriment que abans no ens era conegut. Cal destacar que hem caracteritzat l'estructura i la funció del canal d'insecte en cèl·lules humanes (HEK293S GnTi–) en lloc de en cèl·lules d'insecte. Davant la creixent resistència als insecticides i la pressió contínua sobre la seguretat alimentària i els patògens, el nostre treball proporciona informació important que facilitarà el desenvolupament de nous insecticides en benefici de la salut humana i la seguretat alimentària mundial. Els estudis han demostrat que els insecticides com l'AP són eficaços contra algunes plagues quan s'utilitzen segons les instruccions de l'etiqueta i tenen una baixa toxicitat aguda per als pol·linitzadors beneficiosos, cosa que demostra la seva seguretat ambiental.13,16A més, les proves d'alguns derivats de l'AP en mosquits han demostrat que finalment perden la seva capacitat de volar. Comprendre com aquests compostos moduladors s'uneixen a Nan-Iav facilitarà la modificació dels compostos existents o el desenvolupament de nous compostos per a obtenir-ne de més eficaços i...precíscontrol de plagues. El nostre estudi demostra que la interfície Nan-Iav ARD és crítica no només per regular l'activitat de compostos endògens, pesticides i Ca2+-CaM, sinó també per a l'acoblament de canals. Suggerim que la interrupció de l'acoblament d'heterodímers amb molècules petites pot ser un enfocament únic i prometedor per al desenvolupament d'inhibidors de canals iònics.
Dels vuit gens ortòlegs, es van seleccionar els gens de longitud completa de l'escarabat marró (Halyomorpha halys) Nanchung i Inactive, que mostren una excel·lent estabilitat en detergents. Els gens sintetitzats es van optimitzar en codons per a l'expressió humana i es van clonar al vector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilitzant llocs de restricció XhoI i EcoRI. Això va garantir que els clons estiguessin en el marc de treball amb les etiquetes C-terminals GFP-FLAG-10xHis i mCherry-FLAG-10xHis, que són tallades per la proteasa HRC-3C (PPX), permetent la separació independent.expressióEls encebadors utilitzats per clonar Nanchung i Inactive en el vector pBacMam van ser els següents:
Les imatges microscòpiques de partícules individuals es van obtenir en un microscopi electrònic de transmissió (FEI) Titan Krios G2 equipat amb una càmera K3 i un filtre d'energia Gatan BioQuantum. El microscopi es va operar a 300 keV, amb un ajust d'energia de 20 eV, una mida de píxel de mostra d'1,08 Å/píxel (augment nominal de 81.000x) i un gradient de desenfoque que oscil·lava entre -0,8 i -2,2 μm. L'enregistrament de vídeo es va realitzar a 40 fotogrames per segon utilitzant un microscopi Latitude S (Gatan) amb una taxa de dosi nominal de 25 e–px−1 s−1, un temps d'exposició de 2,4 s i una dosi total d'aproximadament 60 e–Å−2.
La correcció del moviment induït per feix i la ponderació de la dosi es van realitzar en pel·lícula utilitzant MotionCor2 a RELION 4.061. L'estimació del paràmetre de la funció de transferència de contrast (CTF) es va realitzar a cryoSPARC utilitzant el mètode d'estimació CTF basat en pegats62. Les microfotografies amb una resolució d'ajust CTF ≥4 Å es van excloure de l'anàlisi posterior. Normalment, es va utilitzar un subconjunt de 500-1000 microfotografies per a la selecció de punts a cryoSPARC, seguit de diverses rondes de classificació 2D després del filtratge per obtenir una imatge de referència clara per a la selecció de partícules basada en plantilles. A continuació, les partícules es van extreure mitjançant caixes delimitadores de 64 píxels i agrupament de 4 vegades. Es van realitzar diverses rondes de classificació 2D per eliminar categories de partícules no desitjades. El model 3D inicial es va reconstruir mitjançant la reconstrucció ab initio i es va refinar mitjançant el refinament no uniforme a cryoSPARC. La classificació 3D es va realitzar a cryoSPARC o RELION basada en l'heterogeneïtat ARD. No es va observar cap heterogeneïtat significativa dels dominis de membrana. Les partícules es van refinar mitjançant els mètodes C1 i C2; Les partícules amb una resolució C2 més alta es van considerar simètriques respecte a C2 i es van importar a RELION per al refinament bayesià. A continuació, les partícules es van transferir de nou a cryoSPARC per al refinament final no uniforme i local. La resolució final i el recompte de partícules es mostren a la Taula 1.
En el processament de pentàmers Nan+AP, vam explorar diversos mètodes per millorar la resolució dels dominis de membrana (especialment la regió dels porus), com ara la subtracció de senyals i l'emmascarament TMD. Tanmateix, aquests intents no van tenir èxit a causa del desordre potencialment extrem a la regió dels porus i l'heterogeneïtat general del TMD. La resolució final es va calcular utilitzant una màscara generada automàticament pel mètode de processament no uniforme a cryoSPARC, dirigida principalment a la regió ARD. Això va aconseguir una resolució significativament més alta que la dels dominis de membrana (especialment la regió VSLD).
Els models inicials de novo de les formes apo dels insectes Nanchung i Inactive es van generar primer utilitzant Coot63, i els models dels insectes Nan i Iav es van generar utilitzant AlphaFold264 per identificar regions de baixa confiança. El modelatge de calmodulina es va basar en ajustaments de cos rígid dels models d'unió a Ca2+ i lliures de Ca2+ en les accessions PDB 4JPZ56 i 1CFD65, respectivament. Els models es van refinar mitjançant refinament esfèric per garantir l'estereoquímica correcta i una bona geometria. La fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina i la fosfatidilserina es van modelar com a densitats lipídiques ben definides, i els lligands NAM i AP es van col·locar en les densitats corresponents a les unions estretes. Es van generar fitxers de restriccions a partir de la cadena SMILES de les isoformes utilitzant eLBOW a PHENIX66. Finalment, els models es van refinar en l'espai real a PHENIX utilitzant la cerca de quadrícula local i la minimització global amb restriccions d'estructura secundària. El servidor MolProbity es va utilitzar per al refinament del model i l'anàlisi estructural, i les il·lustracions es van realitzar mitjançant PyMOL i UCSF Chimera X.67,68,69 L'anàlisi d'obertura es va realitzar mitjançant el servidor HOLE,70 i el mapatge de conservació de seqüències es va realitzar mitjançant el servidor Consurf.71
L'anàlisi estadística es va dur a terme amb Igor Pro 6.2, Excel Office 365 i GraphPad Prism 7.0. Totes les dades quantitatives es presenten com a mitjana ± error estàndard (SEM). Es va utilitzar la prova t de Student (bilateral, no aparellada) per comparar dos grups. Es va utilitzar l'anàlisi de la variància unidireccional (ANOVA) seguida de la prova post hoc de Dunnett per comparar múltiples grups. *P< 0,05, **P< 0,01, i ***PEs van considerar estadísticament significatius valors < 0,001 segons la distribució de les dades. Els valors de Kd i Ki i els seus intervals de confiança asimètrics del 95% es van calcular mitjançant GraphPad Prism 10.
Per obtenir més detalls sobre la metodologia de l'estudi, consulteu el resum de l'informe Nature Portfolio enllaçat en aquest article.
El model inicial es va construir utilitzant els models de calmodulina de les bases de dades PDB 4JPZ i 1CFD. Les coordenades s'han dipositat al Protein Data Bank (PDB) amb els números d'accés 9NVN (Nan-Iav-CaM sense lligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM unit a nicotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM unit a nicotinamida i EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM unit a afenidolpirrolina i calci), 9NVR (Nan-Iav-CaM unit a afenidolpirrolina i EDTA) i 9NVS (pentàmer Nan unit a afenidolpirrolina). Les imatges de criomicroscòpia electrònica corresponents es troben dipositades a la base de dades de microscòpia electrònica (EMDB) amb els següents números d'accés: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sense lligand), EMD-49845 (complex Nan-Iav-CaM amb nicotinamida), EMD-49846 (complex Nan-Iav-CaM amb nicotinamida i EDTA), EMD-49847 (complex Nan-Iav-CaM amb afidopirrolina i calci), EMD-49848 (complex Nan-Iav-CaM amb afidopirrolina i EDTA) i EMD-49849 (complex Nan pentàmer amb afidopirrolina). Les dades en brut per a l'anàlisi funcional es presenten en aquest article.
Data de publicació: 28 de gener de 2026