En un projecte anterior que va provar plantes locals de processament d'aliments per detectar mosquits a Tailàndia, es va descobrir que els olis essencials (OE) de Cyperus rotundus, galangal i canyella tenien una bona activitat antimosquits contra Aedes aegypti. En un intent de reduir l'ús de productes tradicionalsinsecticidesi millorar el control de les poblacions de mosquits resistents, aquest estudi tenia com a objectiu identificar el sinergisme potencial entre els efectes adulticides de l'òxid d'etilè i la toxicitat de la permetrina per als mosquits Aedes aegypti, incloent-hi les soques resistents i sensibles als piretroides.
Avaluar la composició química i l'activitat letal de l'EO extret dels rizomes de C. rotundus i A. galanga i l'escorça de C. verum contra la soca susceptible Muang Chiang Mai (MCM-S) i la soca resistent Pang Mai Dang (PMD-R). ) Adult actiu d'Ae. Aedes aegypti. També es va realitzar un bioassaig d'adults de la barreja d'EO-permetrina en aquests mosquits Aedes aegypti per comprendre la seva activitat sinèrgica. soques d'Aedes aegypti.
La caracterització química mitjançant el mètode analític GC-MS va mostrar que es van identificar 48 compostos a partir dels OE de C. rotundus, A. galanga i C. verum, que representen el 80,22%, 86,75% i 97,24% del total de components, respectivament. El ciperè (14,04%), el β-bisabolè (18,27%) i el cinamaldehid (64,66%) són els principals components de l'oli de cyperus, l'oli de galangal i l'oli balsàmic, respectivament. En assaigs biològics de matança d'adults, els VE de C. rotundus, A. galanga i C. verum van ser eficaços per matar Ae. aegypti. Els valors de DL50 de MCM-S i PMD-R van ser de 10,05 i 9,57 μg/mg per a femelles, 7,97 i 7,94 μg/mg per a femelles, i 3,30 i 3,22 μg/mg per a femelles, respectivament. L'eficiència de MCM-S i PMD-R Ae en la matança d'adults *. aegypti* en aquests OE va ser propera a la del piperonil butòxid (valors de PBO, DL50 = 6,30 i 4,79 μg/mg femella, respectivament), però no tan pronunciada com la de la permetrina (valors de DL50 = 0,44 i 3,70 ng/mg femella respectivament). No obstant això, els bioassajos combinats van trobar sinergia entre l'OE i la permetrina. Es va observar un sinergisme significatiu amb la permetrina contra dues soques de mosquits *Aedes*. Aedes aegypti en l'EM de *C. rotundus* i *A. galanga*. L'addició d'olis de *C. rotundus* i *A. galanga* va reduir significativament els valors de DL50 de la permetrina en MCM-S de 0,44 a 0,07 ng/mg i 0,11 ng/mg en femelles, respectivament, amb valors de relació de sinergia (SR) de 6,28 i 4,00 respectivament. A més, els OE de C. rotundus i A. galanga també van reduir significativament els valors de DL50 de la permetrina en PMD-R de 3,70 a 0,42 ng/mg i 0,003 ng/mg en femelles, respectivament, amb valors de SR de 8,81 i 1233,33, respectivament.
Efecte sinèrgic d'una combinació d'EO-permetrina per augmentar la toxicitat en adults contra dues soques de mosquits Aedes. Aedes aegypti demostra un paper prometedor per a l'òxid d'etilè com a sinèrgic en la millora de l'eficàcia antimosquits, especialment quan els compostos tradicionals són ineficaços o inadequats.
El mosquit Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) és el principal vector del dengue i altres malalties víriques infeccioses com la febre groga, la chikungunya i el virus Zika, i representa una amenaça enorme i persistent per als humans [1, 2]. El virus del dengue és la febre hemorràgica patògena més greu que afecta els humans, amb una estimació de 5 a 100 milions de casos anuals i més de 2.500 milions de persones en risc a tot el món [3]. Els brots d'aquesta malaltia infecciosa representen una gran càrrega per a les poblacions, els sistemes sanitaris i les economies de la majoria dels països tropicals [1]. Segons el Ministeri de Salut tailandès, el 2015 es van registrar 142.925 casos de dengue i 141 morts a tot el país, més de tres vegades el nombre de casos i morts del 2014 [4]. Malgrat les proves històriques, el mosquit Aedes ha erradicat o reduït considerablement el dengue. Després del control de l'Aedes aegypti [5], les taxes d'infecció van augmentar dràsticament i la malaltia es va estendre per tot el món, en part a causa de dècades d'escalfament global. L'eliminació i el control de l'Ae. Aedes aegypti és relativament difícil perquè és un mosquit vector domèstic que s'aparella, s'alimenta, descansa i pon ous dins i al voltant dels habitatges humans durant el dia. A més, aquest mosquit té la capacitat d'adaptar-se als canvis ambientals o a les pertorbacions causades per esdeveniments naturals (com la sequera) o mesures de control humanes, i pot tornar al seu nombre original [6, 7]. Com que les vacunes contra la febre del dengue només s'han aprovat recentment i no hi ha cap tractament específic per a la febre del dengue, la prevenció i la reducció del risc de transmissió del dengue depèn completament del control dels mosquits vectors i de l'eliminació del contacte humà amb els vectors.
En particular, l'ús de productes químics per al control de mosquits juga ara un paper important en la salut pública com a component important de la gestió integrada de vectors. Els mètodes químics més populars inclouen l'ús d'insecticides de baixa tòxicitat que actuen contra les larves de mosquit (larvicides) i els mosquits adults (adidocides). Es considera important el control larvari mitjançant la reducció de la font i l'ús regular de larvicides químics com ara organofosfats i reguladors del creixement dels insectes. Tanmateix, els impactes ambientals adversos associats amb els pesticides sintètics i el seu manteniment complex i laboriós continuen sent una preocupació important [8, 9]. El control actiu tradicional dels vectors, com ara el control d'adults, continua sent el mitjà de control més eficaç durant els brots virals, ja que pot eradicar els vectors de malalties infeccioses ràpidament i a gran escala, així com reduir la vida útil i la longevitat de les poblacions de vectors locals [3], 10]. Quatre classes d'insecticides químics: organoclorats (anomenats només DDT), organofosfats, carbamats i piretroides formen la base dels programes de control de vectors, i els piretroides es consideren la classe més reeixida. Són altament eficaços contra diversos artròpodes i tenen una baixa efectivitat. toxicitat per als mamífers. Actualment, els piretroides sintètics constitueixen la majoria dels pesticides comercials, representant aproximadament el 25% del mercat mundial de pesticides [11, 12]. La permetrina i la deltametrina són insecticides piretroides d'ampli espectre que s'han utilitzat a tot el món durant dècades per controlar diverses plagues d'importància agrícola i mèdica [13, 14]. A la dècada de 1950, el DDT va ser seleccionat com a producte químic preferit per al programa nacional de control de mosquits de salut pública de Tailàndia. Arran de l'ús generalitzat del DDT a les zones endèmiques de la malària, Tailàndia va eliminar gradualment l'ús del DDT entre 1995 i 2000 i el va substituir per dos piretroides: la permetrina i la deltametrina [15, 16]. Aquests insecticides piretroides es van introduir a principis de la dècada de 1990 per controlar la malària i el dengue, principalment mitjançant tractaments amb mosquiteres i l'ús de boires tèrmiques i aerosols de toxicitat ultrabaixa [14, 17]. Tanmateix, han perdut efectivitat a causa de la forta resistència dels mosquits i la manca de compliment públic a causa de les preocupacions sobre la salut pública i l'impacte ambiental dels productes químics sintètics. Això planteja reptes importants per a l'èxit dels programes de control de vectors d'amenaces [14, 18, 19]. Per fer que l'estratègia sigui més eficaç, calen contramesures oportunes i adequades. Els procediments de gestió recomanats inclouen la substitució de substàncies naturals, la rotació de productes químics de diferents classes, l'addició de sinergistes i la barreja de productes químics o l'aplicació simultània de productes químics de diferents classes [14, 20, 21]. Per tant, hi ha una necessitat urgent de trobar i desenvolupar una alternativa i sinergista respectuosos amb el medi ambient, convenients i eficaços, i aquest estudi pretén abordar aquesta necessitat.
Els insecticides d'origen natural, especialment els basats en components vegetals, han demostrat potencial en l'avaluació d'alternatives actuals i futures per al control de mosquits [22, 23, 24]. Diversos estudis han demostrat que és possible controlar vectors importants de mosquits mitjançant l'ús de productes vegetals, especialment olis essencials (OE), com a insecticides adults. S'han trobat propietats adulticides contra algunes espècies importants de mosquits en molts olis vegetals com l'api, el comí, la zedoària, l'anís, el pebre de pipa, el farigola, Schinus terebinthifolia, Cymbopogon citratus, Cymbopogon schoenanthus, Cymbopogon giganteus, Chenopodium ambrosioides, Cochlospermum planchonii, Eucalyptus ter eticornis, Eucalyptus citriodora, Cananga odorata i Petroselinum Criscum [25,26,27,28,29,30]. L'òxid d'etilè s'utilitza ara no només sol, sinó també en combinació amb substàncies vegetals extretes o pesticides sintètics existents, produint diversos graus de toxicitat. Les combinacions d'insecticides tradicionals com ara organofosfats, carbamats i piretroides amb òxid d'etilè/extractes de plantes actuen de manera sinèrgica o antagonista en els seus efectes tòxics i s'ha demostrat que són efectives contra els vectors de malalties i les plagues [31,32,33,34,35]. Tanmateix, la majoria dels estudis sobre els efectes tòxics sinèrgics de combinacions de fitoquímics amb o sense productes químics sintètics s'han dut a terme en vectors d'insectes agrícoles i plagues en lloc de mosquits d'importància mèdica. A més, la major part del treball sobre els efectes sinèrgics de les combinacions d'insecticides sintètics vegetals contra els vectors de mosquits s'ha centrat en l'efecte larvicida.
En un estudi previ realitzat pels autors com a part d'un projecte de recerca en curs que examinava els intimicides de plantes alimentàries indígenes a Tailàndia, es va trobar que els òxids d'etilè de Cyperus rotundus, galangal i canyella tenien activitat potencial contra els adults d'Aedes aegypti [36]. Per tant, aquest estudi tenia com a objectiu avaluar l'eficàcia dels OE aïllats d'aquestes plantes medicinals contra els mosquits Aedes aegypti, incloent-hi soques resistents i sensibles als piretroides. També s'ha analitzat l'efecte sinèrgic de mescles binàries d'òxid d'etilè i piretroides sintètics amb bona eficàcia en adults per reduir l'ús d'insecticides tradicionals i augmentar la resistència als vectors de mosquits, especialment contra Aedes aegypti. Aquest article informa de la caracterització química d'olis essencials eficaços i el seu potencial per augmentar la toxicitat de la permetrina sintètica contra els mosquits Aedes aegypti en soques sensibles als piretroides (MCM-S) i soques resistents (PMD-R).
Els rizomes de C. rotundus i A. galanga i l'escorça de C. verum (Fig. 1) utilitzats per a l'extracció d'oli essencial es van comprar a proveïdors de plantes medicinals a la província de Chiang Mai, Tailàndia. La identificació científica d'aquestes plantes es va aconseguir mitjançant consultes amb el Sr. James Franklin Maxwell, botànic d'herbari, Departament de Biologia, Facultat de Ciències, Universitat de Chiang Mai (CMU), província de Chiang Mai, Tailàndia, i el científic Wannari Charoensap; al Departament de Farmàcia, Facultat de Farmàcia, Universitat Carnegie Mellon, la Sra. Voucher mostra de cada planta s'emmagatzemen al Departament de Parasitologia de la Facultat de Medicina de la Universitat Carnegie Mellon per a ús futur.
Les mostres de plantes es van assecar individualment a l'ombra durant 3-5 dies en un espai obert amb ventilació activa i una temperatura ambient d'aproximadament 30 ± 5 °C per eliminar el contingut d'humitat abans de l'extracció dels olis essencials naturals (OE). Es van moldre mecànicament un total de 250 g de cada material vegetal sec fins a obtenir una pols gruixuda i es van utilitzar per aïllar olis essencials (OE) mitjançant destil·lació al vapor. L'aparell de destil·lació consistia en una manta calefactor elèctrica, un matràs de fons rodó de 3000 mL, una columna d'extracció, un condensador i un dispositiu Cool ace (Eyela Cool Ace CA-1112 CE, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tòquio, Japó). Afegiu 1600 ml d'aigua destil·lada i 10-15 perles de vidre al matràs i després escalfeu-lo a aproximadament 100 °C utilitzant un escalfador elèctric durant almenys 3 hores fins que la destil·lació s'hagi completat i no es produeixi més OE. La capa d'EO es va separar de la fase aquosa mitjançant un embut de decantació, es va assecar sobre sulfat de sodi anhidre (Na2SO4) i es va emmagatzemar en una ampolla marró segellada a 4 °C fins que es van examinar la composició química i l'activitat adulta.
La composició química dels olis essencials es va dur a terme simultàniament amb el bioassaig de la substància adulta. L'anàlisi qualitativa es va realitzar mitjançant un sistema GC-MS que consistia en un cromatògraf de gasos Hewlett-Packard (Wilmington, CA, EUA) 7890A equipat amb un detector selectiu de masses quadrupol únic (Agilent Technologies, Wilmington, CA, EUA) i un MSD 5975C (EI). (Agilent Technologies).
Columna cromatogràfica: DB-5MS (30 m × DI 0,25 mm × gruix de la pel·lícula 0,25 µm). El temps total d'execució de GC-MS va ser de 20 minuts. Les condicions d'anàlisi són que les temperatures de l'injector i de la línia de transferència siguin de 250 i 280 °C, respectivament; la temperatura del forn s'estableix per augmentar de 50 °C a 250 °C a una velocitat de 10 °C/min, el gas portador sigui heli; cabal d'1,0 ml/min; volum d'injecció de 0,2 µL (1/10% en volum en CH2Cl2, proporció de divisió 100:1); per a la detecció de GC-MS s'utilitza un sistema d'ionització d'electrons amb una energia d'ionització de 70 eV. El rang d'adquisició és de 50 a 550 unitats de massa atòmica (amu) i la velocitat d'escaneig és de 2,91 escanejos per segon. Els percentatges relatius dels components s'expressen com a percentatges normalitzats per l'àrea del pic. La identificació dels ingredients de l'EO es basa en el seu índex de retenció (RI). El RI es va calcular utilitzant l'equació de Van den Dool i Kratz [37] per a la sèrie de n-alcans (C8-C40) i es va comparar amb els índexs de retenció de la literatura [38] i les bases de dades de biblioteques (NIST 2008 i Wiley 8NO8). La identitat dels compostos mostrats, com ara l'estructura i la fórmula molecular, es va confirmar mitjançant la comparació amb mostres autèntiques disponibles.
Els estàndards analítics per a la permetrina sintètica i el butòxid de piperonil (PBO, control positiu en estudis de sinergia) es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Els kits de proves per a adults de l'Organització Mundial de la Salut (OMS) i les dosis diagnòstiques de paper impregnat amb permetrina (0,75%) es van comprar comercialment al Centre de Control de Vectors de l'OMS a Penang, Malàisia. Tots els altres productes químics i reactius utilitzats eren de grau analític i es van comprar a institucions locals de la província de Chiang Mai, Tailàndia.
Els mosquits utilitzats com a organismes de prova en el bioassaig d'adults eren mosquits Aedes aegypti de laboratori que s'aparellaven lliurement, incloent-hi la soca susceptible de Muang Chiang Mai (MCM-S) i la soca resistent de Pang Mai Dang (PMD-R). La soca MCM-S es va obtenir de mostres locals recollides a la zona de Muang Chiang Mai, província de Chiang Mai, Tailàndia, i s'ha mantingut a la sala d'entomologia del Departament de Parasitologia de la Facultat de Medicina de la CMU, des del 1995 [39]. La soca PMD-R, que es va trobar resistent a la permetrina, es va aïllar de mosquits de camp recollits originalment a Ban Pang Mai Dang, districte de Mae Tang, província de Chiang Mai, Tailàndia, i s'ha mantingut al mateix institut des del 1997 [40]. Les soques PMD-R es van cultivar sota pressió selectiva per mantenir els nivells de resistència mitjançant l'exposició intermitent a un 0,75% de permetrina utilitzant el kit de detecció de l'OMS amb algunes modificacions [41]. Cada soca d'Ae. L'Aedes aegypti es va colonitzar individualment en un laboratori lliure de patògens a 25 ± 2 °C i una humitat relativa del 80 ± 10% i un fotoperíode de llum/foscor de 14:10 h. Es van mantenir aproximadament 200 larves en safates de plàstic (33 cm de llarg, 28 cm d'ample i 9 cm d'alt) plenes d'aigua de l'aixeta amb una densitat de 150-200 larves per safata i es van alimentar dues vegades al dia amb galetes per a gossos esterilitzades. Els cucs adults es van mantenir en gàbies humides i es van alimentar contínuament amb una solució aquosa de sacarosa al 10% i una solució de xarop multivitamínic al 10%. Les femelles de mosquit xuclen sang regularment per pondre ous. Les femelles de dos a cinc dies d'edat que no han estat alimentades amb sang es poden utilitzar contínuament en assaigs biològics experimentals per a adults.
Es va realitzar un bioassaig de resposta a la dosi-mortalitat d'EO en mosquits femelles adultes Aedes aegypti, MCM-S i PMD-R utilitzant un mètode tòpic modificat segons el protocol estàndard de l'OMS per a proves de susceptibilitat [42]. L'EO de cada planta es va diluir en sèrie amb un dissolvent adequat (per exemple, etanol o acetona) per obtenir una sèrie graduada de 4-6 concentracions. Després de l'anestèsia amb diòxid de carboni (CO2), els mosquits es van pesar individualment. Els mosquits anestesiats es van mantenir immòbils sobre paper de filtre sec en una placa freda personalitzada sota un estereomicroscopi per evitar la reactivació durant el procediment. Per a cada tractament, es van aplicar 0,1 μl de solució d'EO al pronot superior de la femella utilitzant un microdispensador de mà Hamilton (700 Series Microliter™, Hamilton Company, Reno, NV, EUA). Es van tractar vint-i-cinc femelles amb cada concentració, amb una mortalitat que oscil·lava entre el 10% i el 95% per a almenys 4 concentracions diferents. Els mosquits tractats amb dissolvent van servir com a control. Per evitar la contaminació de les mostres de prova, substituïu el paper de filtre per un paper de filtre nou per a cada EO provat. Les dosis utilitzades en aquests bioassajos s'expressen en micrograms d'EO per mil·ligram de pes corporal femení viu. L'activitat del PBO adult també es va avaluar de manera similar a l'EO, amb el PBO utilitzat com a control positiu en experiments sinèrgics. Els mosquits tractats de tots els grups es van col·locar en gots de plàstic i se'ls va administrar sacarosa al 10% més xarop multivitamínic al 10%. Tots els bioassajos es van realitzar a 25 ± 2 °C i 80 ± 10% d'humitat relativa i es van repetir quatre vegades amb els controls. La mortalitat durant el període de cria de 24 hores es va comprovar i confirmar per la manca de resposta del mosquit a l'estimulació mecànica i després es va registrar en funció de la mitjana de quatre rèpliques. Els tractaments experimentals es van repetir quatre vegades per a cada mostra de prova utilitzant diferents lots de mosquits. Els resultats es van resumir i es van utilitzar per calcular el percentatge de taxa de mortalitat, que es va utilitzar per determinar la dosi letal de 24 hores mitjançant anàlisi probit.
L'efecte anticidal sinèrgic de l'EO i la permetrina es va avaluar mitjançant un procediment d'assaig de toxicitat local [42], tal com s'ha descrit anteriorment. Es va utilitzar acetona o etanol com a dissolvent per preparar la permetrina a la concentració desitjada, així com una barreja binària d'EO i permetrina (EO-permetrina: permetrina barrejada amb EO a una concentració DL25). Es van avaluar els kits de prova (permetrina i EO-permetrina) contra les soques MCM-S i PMD-R d'Ae. Aedes aegypti. Es van administrar quatre dosis de permetrina a cadascun dels 25 mosquits femelles per comprovar la seva eficàcia en la mort d'adults, i cada tractament es va repetir quatre vegades. Per identificar els candidats a sinergistes d'EO, es van administrar de 4 a 6 dosis d'EO-permetrina a cadascun dels 25 mosquits femelles, i cada aplicació es va repetir quatre vegades. El tractament amb PBO-permetrina (permetrina barrejada amb concentració DL25 de PBO) també va servir com a control positiu. Les dosis utilitzades en aquests bioassajos s'expressen en nanograms de mostra de prova per mil·ligram de pes corporal femella viva. Es van dur a terme quatre avaluacions experimentals per a cada soca de mosquit en lots criats individualment, i les dades de mortalitat es van agrupar i analitzar mitjançant Probit per determinar una dosi letal de 24 hores.
La taxa de mortalitat es va ajustar mitjançant la fórmula d'Abbott [43]. Les dades ajustades es van analitzar mitjançant una anàlisi de regressió Probit amb el programa estadístic SPSS (versió 19.0). Els valors letals del 25%, 50%, 90%, 95% i 99% (DL25, DL50, DL90, DL95 i DL99, respectivament) es van calcular utilitzant els intervals de confiança del 95% corresponents (IC del 95%). Les mesures de significació i les diferències entre les mostres de prova es van avaluar mitjançant la prova de khi quadrat o la prova U de Mann-Whitney dins de cada assaig biològic. Els resultats es van considerar estadísticament significatius a P< 0,05. El coeficient de resistència (RR) s'estima al nivell LD50 mitjançant la fórmula següent [12]:
RR > 1 indica resistència i RR ≤ 1 indica sensibilitat. El valor de la relació de sinergia (SR) de cada candidat sinergista es calcula de la manera següent [34, 35, 44]:
Aquest factor divideix els resultats en tres categories: un valor SR d'1 ± 0,05 es considera que no té cap efecte aparent, un valor SR de > 1,05 es considera que té un efecte sinèrgic i un valor SR d'un oli líquid groc clar es pot obtenir mitjançant destil·lació al vapor dels rizomes de C. rotundus i A. galanga i l'escorça de C. verum. Els rendiments calculats en pes sec van ser del 0,15%, 0,27% (p/p) i 0,54% (v/v). p) respectivament (Taula 1). L'estudi de GC-MS de la composició química dels olis de C. rotundus, A. galanga i C. verum va mostrar la presència de 19, 17 i 21 compostos, que representaven el 80,22, 86,75 i 97,24% de tots els components, respectivament (Taula 2). Els compostos d'oli de rizoma de C. lucidum consisteixen principalment en ciperonè (14,04%), seguit de carralè (9,57%), α-capselan (7,97%) i α-capselan (7,53%). El principal component químic de l'oli de rizoma de galangal és el β-bisabolè (18,27%), seguit de l'α-bergamotè (16,28%), l'1,8-cineol (10,17%) i el piperonol (10,09%). Mentre que el cinnamaldehid (64,66%) es va identificar com el component principal de l'oli d'escorça de C. verum, l'acetat cinàmic (6,61%), l'α-copaè (5,83%) i el 3-fenilpropionaldehid (4,09%) es van considerar ingredients minoritaris. Les estructures químiques del cipernè, el β-bisabolè i el cinnamaldehid són els principals compostos de C. rotundus, A. galanga i C. verum, respectivament, tal com es mostra a la Figura 2.
Els resultats de tres OO van avaluar l'activitat dels adults contra els mosquits Aedes aegypti es mostren a la Taula 3. Es va trobar que tots els OO tenien efectes letals sobre els mosquits Aedes MCM-S en diferents tipus i dosis. Aedes aegypti. L'OO més eficaç és C. verum, seguit d'A. galanga i C. rotundus amb valors de DL50 de 3,30, 7,97 i 10,05 μg/mg MCM-S en femelles respectivament, lleugerament superiors a 3,22 (U = 1), Z = -0,775, P = 0,667), 7,94 (U = 2, Z = 0, P = 1) i 9,57 (U = 0, Z = -1,549, P = 0,333) μg/mg PMD-R en dones. Això correspon a que el PBO té un efecte adult lleugerament superior sobre el PMD-R que la soca MSM-S, amb valors de DL50 de 4,79 i 6,30 μg/mg en femelles, respectivament (U = 0, Z = -2,021, P = 0,057). Es pot calcular que els valors de DL50 de C. verum, A. galanga, C. rotundus i PBO contra el PMD-R són aproximadament 0,98, 0,99, 0,95 i 0,76 vegades inferiors als contra el MCM-S, respectivament. Per tant, això indica que la susceptibilitat al PBO i a l'EO és relativament similar entre les dues soques d'Aedes. Tot i que el PMD-R era més susceptible que el MCM-S, la sensibilitat d'Aedes aegypti no va ser significativa. En canvi, les dues soques d'Aedes diferien molt en la seva sensibilitat a la permetrina aegypti (Taula 4). El PMD-R va demostrar una resistència significativa a la permetrina (valor LD50 = 0,44 ng/mg en dones) amb un valor LD50 més alt de 3,70 en comparació amb el MCM-S (valor LD50 = 0,44 ng/mg en dones) ng/mg en dones (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Tot i que el PMD-R és molt menys sensible a la permetrina que el MCM-S, la seva sensibilitat al PBO i als olis de C. verum, A. galanga i C. rotundus és lleugerament superior a la del MCM-S.
Com es va observar en el bioassaig de població adulta de la combinació EO-permetrina, les mescles binàries de permetrina i EO (DL25) van mostrar sinergia (valor SR > 1,05) o cap efecte (valor SR = 1 ± 0,05). Efectes complexos en adults d'una barreja EO-permetrina en mosquits albins experimentals. Les soques d'Aedes aegypti MCM-S i PMD-R es mostren a la Taula 4 i la Figura 3. Es va trobar que l'addició d'oli de C. verum reduïa lleugerament la DL50 de la permetrina contra MCM-S i augmentava lleugerament la DL50 contra PMD-R a 0,44-0,42 ng/mg en dones i de 3,70 a 3,85 ng/mg en dones, respectivament. En canvi, l'addició d'olis de C. rotundus i A. galanga va reduir significativament la DL50 de la permetrina en MCM-S de 0,44 a 0,07 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) i a 0,11 (U = 0). , Z) = -2,309, P = 0,029) ng/mg en dones. Basant-se en els valors de DL50 de MCM-S, els valors de SR de la barreja EO-permetrina després de l'addició d'olis de C. rotundus i A. galanga van ser de 6,28 i 4,00, respectivament. En conseqüència, la DL50 de la permetrina contra el PMD-R va disminuir significativament de 3,70 a 0,42 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) i a 0,003 amb l'addició d'olis de C. rotundus i A. galanga (U = 0). , Z = -2,337, P = 0,029) ng/mg femella. El valor d'SR de la permetrina combinada amb C. rotundus contra el PMD-R va ser de 8,81, mentre que el valor d'SR de la barreja de galangal i permetrina va ser de 1233,33. En relació amb MCM-S, el valor DL50 del PBO de control positiu va disminuir de 0,44 a 0,26 ng/mg (femelles) i de 3,70 ng/mg (femelles) a 0,65 ng/mg (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) i PMD-R (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Els valors SR de la barreja PBO-permetrina per a les soques MCM-S i PMD-R van ser 1,69 i 5,69, respectivament. Aquests resultats indiquen que els olis de C. rotundus i A. galanga i el PBO augmenten la toxicitat de la permetrina en major mesura que l'oli de C. verum per a les soques MCM-S i PMD-R.
Activitat en adults (DL50) d'EO, PBO, permetrina (PE) i les seves combinacions contra soques de mosquits Aedes sensibles als piretroides (MCM-S) i resistents (PMD-R). Aedes aegypti
[45] Els piretroides sintètics s'utilitzen a tot el món per controlar gairebé tots els artròpodes d'importància agrícola i mèdica. Tanmateix, a causa de les conseqüències nocives de l'ús d'insecticides sintètics, especialment pel que fa al desenvolupament i la resistència generalitzada dels mosquits, així com l'impacte en la salut a llarg termini i el medi ambient, ara hi ha una necessitat urgent de reduir l'ús d'insecticides sintètics tradicionals i desenvolupar alternatives [35, 46, 47]. A més de protegir el medi ambient i la salut humana, els avantatges dels insecticides botànics inclouen una alta selectivitat, disponibilitat global i facilitat de producció i ús, cosa que els fa més atractius per al control de mosquits [32,48, 49]. Aquest estudi, a més d'elucidar les característiques químiques dels olis essencials eficaços mitjançant l'anàlisi GC-MS, també va avaluar la potència dels olis essencials adults i la seva capacitat per augmentar la toxicitat de la permetrina sintètica *Aegypti* en soques sensibles als piretroides (MCM-S) i soques resistents (PMD-R).
La caracterització per GC-MS va mostrar que el cipern (14,04%), el β-bisabolè (18,27%) i el cinnamaldehid (64,66%) eren els components principals dels olis de C. rotundus, A. galanga i C. verum, respectivament. Aquests productes químics han demostrat diverses activitats biològiques. Ahn et al. [50] van informar que el 6-acetoxiciperè, aïllat del rizoma de C. rotundus, actua com a compost antitumoral i pot induir apoptosi dependent de caspases en cèl·lules de càncer d'ovari. El β-bisabolè, extret de l'oli essencial de l'arbre de mirra, presenta citotoxicitat específica contra cèl·lules tumorals mamàries humanes i de ratolí tant in vitro com in vivo [51]. S'ha informat que el cinnamaldehid, obtingut a partir d'extractes naturals o sintetitzat al laboratori, té activitats insecticides, antibacterianes, antifúngiques, antiinflamatòries, immunomoduladores, anticancerígenes i antiangiogèniques [52].
Els resultats del bioassaig d'activitat en adults dependent de la dosi van mostrar un bon potencial dels OE provats i van mostrar que les soques de mosquit Aedes MCM-S i PMD-R tenien una susceptibilitat similar a l'OE i al PBO. Aedes aegypti. Una comparació de l'eficàcia de l'OE i la permetrina va mostrar que aquesta última té un efecte al·lergicida més fort: els valors de DL50 són de 0,44 i 3,70 ng/mg en femelles per a les soques MCM-S i PMD-R, respectivament. Aquestes troballes estan recolzades per molts estudis que mostren que els pesticides naturals, especialment els productes derivats de plantes, són generalment menys eficaços que les substàncies sintètiques [31, 34, 35, 53, 54]. Això pot ser degut al fet que el primer és una combinació complexa d'ingredients actius o inactius, mentre que el segon és un compost actiu únic purificat. Tanmateix, la diversitat i la complexitat dels ingredients actius naturals amb diferents mecanismes d'acció poden millorar l'activitat biològica o dificultar el desenvolupament de resistència en les poblacions hostes [55, 56, 57]. Molts investigadors han informat del potencial antimosquit de C. verum, A. galanga i C. rotundus i els seus components com el β-bisabolè, el cinnamaldehid i l'1,8-cineol [22, 36, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64]. Tanmateix, una revisió de la literatura va revelar que no hi ha hagut informes previs del seu efecte sinèrgic amb la permetrina o altres insecticides sintètics contra els mosquits Aedes. Aedes aegypti.
En aquest estudi, es van observar diferències significatives en la susceptibilitat a la permetrina entre les dues soques d'Aedes aegypti. L'MCM-S és sensible a la permetrina, mentre que el PMD-R hi és molt menys sensible, amb una taxa de resistència del 8,41. En comparació amb la sensibilitat de l'MCM-S, el PMD-R és menys sensible a la permetrina però més sensible a l'EO, cosa que proporciona una base per a futurs estudis destinats a augmentar l'eficàcia de la permetrina combinant-la amb EO. Un bioassaig basat en combinacions sinèrgiques per als efectes en adults va mostrar que les mescles binàries d'EO i permetrina van reduir o augmentar la mortalitat d'Aedes aegypti adults. L'addició d'oli de C. verum va disminuir lleugerament la DL50 de la permetrina contra l'MCM-S però va augmentar lleugerament la DL50 contra el PMD-R amb valors de SR d'1,05 i 0,96, respectivament. Això indica que l'oli de C. verum no té un efecte sinèrgic o antagonista sobre la permetrina quan es va provar amb MCM-S i PMD-R. En canvi, els olis de C. rotundus i A. galanga van mostrar un efecte sinèrgic significatiu en reduir significativament els valors DL50 de la permetrina sobre MCM-S o PMD-R. Quan la permetrina es va combinar amb EO de C. rotundus i A. galanga, els valors SR de la barreja EO-permetrina per a MCM-S van ser 6,28 i 4,00, respectivament. A més, quan la permetrina es va avaluar contra PMD-R en combinació amb C. rotundus (SR = 8,81) o A. galanga (SR = 1233,33), els valors SR van augmentar significativament. Cal destacar que tant C. rotundus com A. galanga van augmentar significativament la toxicitat de la permetrina contra el PMD-R Ae. aegypti. De la mateixa manera, es va trobar que el PBO augmentava la toxicitat de la permetrina amb valors de SR d'1,69 i 5,69 per a les soques MCM-S i PMD-R, respectivament. Com que C. rotundus i A. galanga tenien els valors de SR més alts, es van considerar els millors sinèrgics per augmentar la toxicitat de la permetrina sobre MCM-S i PMD-R, respectivament.
Diversos estudis anteriors han informat de l'efecte sinèrgic de combinacions d'insecticides sintètics i extractes de plantes contra diverses espècies de mosquits. Un bioassaig larvicida contra Anopheles Stephensi estudiat per Kalayanasundaram i Das [65] va mostrar que el fentió, un organofosforat d'ampli espectre, estava associat amb Cleodendron inerme, Pedalium murax i Parthenium hysterophorus. Es va observar una sinergia significativa entre els extractes amb un efecte sinèrgic (SF) d'1,31, 1,38, 1,40, 1,48, 1,61 i 2,23, respectivament. En un cribratge larvicida de 15 espècies de manglars, es va trobar que l'extracte d'èter de petroli d'arrels de manglar era més eficaç contra Culex quinquefasciatus amb un valor LC50 de 25,7 mg/L [66]. També es va informar que l'efecte sinèrgic d'aquest extracte i l'insecticida botànic piretre reduïa la CL50 del piretre contra les larves de C. quinquefasciatus de 0,132 mg/L a 0,107 mg/L; a més, en aquest estudi es va utilitzar un càlcul de SF d'1,23. 34,35,44]. Es va avaluar l'eficàcia combinada de l'extracte d'arrel de Solanum citron i diversos insecticides sintètics (per exemple, fentió, cipermetrina (un piretroide sintètic) i timetfòs (un larvicida organofosforat)) contra els mosquits Anopheles. Stephensi [54] i C. quinquefasciatus [34]. L'ús combinat de cipermetrina i extracte d'èter de petroli de fruit groc va mostrar un efecte sinèrgic sobre la cipermetrina en totes les proporcions. La proporció més efectiva va ser la combinació binària 1:1 amb valors de CL50 i SF de 0,0054 ppm i 6,83, respectivament, en relació amb An. Stephen West [54]. Mentre que una barreja binària 1:1 de S. xanthocarpum i temefos va ser antagonista (SF = 0,6406), la combinació S. xanthocarpum-fention (1:1) va exhibir activitat sinèrgica contra C. quinquefasciatus amb un SF d'1,3125 [34]]. Tong i Blomquist [35] van estudiar els efectes de l'òxid d'etilè vegetal sobre la toxicitat del carbaril (un carbamat d'ampli espectre) i la permetrina per als mosquits Aedes. Aedes aegypti. Els resultats van mostrar que l'òxid d'etilè de l'agar, el pebre negre, el ginebró, l'helichrysum, el sàndal i el sèsam va augmentar la toxicitat del carbaril per als mosquits Aedes aegypti. Els valors de SR de les larves d'Aedes aegypti varien d'1,0 a 7,0. En canvi, cap dels OE va ser tòxic per als mosquits Aedes adults. En aquesta fase, no s'han reportat efectes sinèrgics per a la combinació d'Aedes aegypti i EO-carbaril. El PBO es va utilitzar com a control positiu per augmentar la toxicitat del carbaril contra els mosquits Aedes. Els valors de SR de les larves i els adults d'Aedes aegypti són de 4,9-9,5 i 2,3, respectivament. Només es van provar mescles binàries de permetrina i EO o PBO per a l'activitat larvicida. La barreja EO-permetrina va tenir un efecte antagonista, mentre que la barreja PBO-permetrina va tenir un efecte sinèrgic contra els mosquits Aedes. Larves d'Aedes aegypti. Tanmateix, encara no s'han realitzat experiments dosi-resposta ni avaluació de SR per a mescles de PBO-permetrina. Tot i que s'han obtingut pocs resultats pel que fa als efectes sinèrgics de les combinacions fitosintètiques contra els vectors de mosquits, aquestes dades donen suport als resultats existents, que obren la possibilitat d'afegir sinèrgics no només per reduir la dosi aplicada, sinó també per augmentar l'efecte mortal. Eficiència dels insectes. A més, els resultats d'aquest estudi van demostrar per primera vegada que els olis de C. rotundus i A. galanga exerceixen sinèrgicament una eficàcia significativament més alta contra soques de mosquits Aedes susceptibles i resistents als piretroides en comparació amb el PBO quan es combinen amb la toxicitat de la permetrina. Aedes aegypti. Tanmateix, resultats inesperats de l'anàlisi sinèrgica van mostrar que l'oli de C. verum tenia la major activitat antiadults contra ambdues soques d'Aedes. Sorprenentment, l'efecte tòxic de la permetrina sobre Aedes aegypti va ser insatisfactori. Les variacions en els efectes tòxics i els efectes sinèrgics poden ser degudes en part a l'exposició a diferents tipus i nivells de components bioactius en aquests olis.
Malgrat els esforços per entendre com millorar l'eficiència, els mecanismes sinèrgics continuen sense estar clars. Les possibles raons de la diferent eficàcia i potencial sinèrgic poden incloure diferències en la composició química dels productes provats i diferències en la susceptibilitat als mosquits associades amb l'estat i el desenvolupament de la resistència. Hi ha diferències entre els components principals i minoritaris de l'òxid d'etilè provats en aquest estudi, i s'ha demostrat que alguns d'aquests compostos tenen efectes repel·lents i tòxics contra una varietat de plagues i vectors de malalties [61,62,64,67,68]. Tanmateix, els principals compostos caracteritzats en els olis de C. rotundus, A. galanga i C. verum, com ara el cipern, el β-bisabolè i el cinamalaldehid, no es van provar en aquest article per les seves activitats antiadults i sinèrgiques contra Ae, respectivament. Aedes aegypti. Per tant, calen futurs estudis per aïllar els ingredients actius presents a cada oli essencial i dilucidar la seva eficàcia insecticida i les interaccions sinèrgiques contra aquest vector de mosquits. En general, l'activitat insecticida depèn de l'acció i la reacció entre els verins i els teixits dels insectes, que es pot simplificar i dividir en tres etapes: penetració a la pell del cos de l'insecte i a les membranes de l'òrgan diana, activació (= interacció amb la diana) i desintoxicació de substàncies tòxiques [57, 69]. Per tant, el sinergisme insecticida que resulta en una major eficàcia de les combinacions de tòxics requereix almenys una d'aquestes categories, com ara una major penetració, una major activació dels compostos acumulats o una desintoxicació menys reduïda de l'ingredient actiu del pesticida. Per exemple, la tolerància energètica retarda la penetració de la cutícula a través d'una cutícula engrossida i la resistència bioquímica, com ara un metabolisme insecticida millorat observat en algunes soques d'insectes resistents [70, 71]. L'eficàcia significativa dels OE per augmentar la toxicitat de la permetrina, especialment contra el PMD-R, pot indicar una solució al problema de la resistència als insecticides mitjançant la interacció amb els mecanismes de resistència [57, 69, 70, 71]. Tong i Blomquist [35] van recolzar els resultats d'aquest estudi demostrant una interacció sinèrgica entre els OE i els pesticides sintètics. aegypti, hi ha evidència d'activitat inhibidora contra els enzims desintoxicants, incloent-hi les monooxigenases i carboxilesterases del citocrom P450, que estan estretament associades amb el desenvolupament de la resistència als pesticides tradicionals. No només es diu que el PBO és un inhibidor metabòlic de la monooxigenasa del citocrom P450, sinó que també millora la penetració dels insecticides, com ho demostra el seu ús com a control positiu en estudis sinèrgics [35, 72]. Curiosament, l'1,8-cineol, un dels components importants que es troben a l'oli de galangal, és conegut pels seus efectes tòxics sobre les espècies d'insectes [22, 63, 73] i s'ha informat que té efectes sinèrgics en diverses àrees de recerca de l'activitat biològica [74]. . ,75,76,77]. A més, l'1,8-cineol en combinació amb diversos fàrmacs, com ara la curcumina [78], el 5-fluorouracil [79], l'àcid mefenàmic [80] i la zidovudina [81] també té un efecte promotor de la permeació. in vitro. Així doncs, el possible paper de l'1,8-cineol en l'acció insecticida sinèrgica no és només com a ingredient actiu, sinó també com a potenciador de la penetració. A causa d'un major sinergisme amb la permetrina, especialment contra el PMD-R, els efectes sinèrgics de l'oli de galangal i l'oli de trichosante observats en aquest estudi poden ser el resultat d'interaccions amb mecanismes de resistència, és a dir, una major permeabilitat al clor. Els piretroides augmenten l'activació dels compostos acumulats i inhibeixen els enzims desintoxicants com les monooxigenases i les carboxilesterases del citocrom P450. Tanmateix, aquests aspectes requereixen més estudis per dilucidar el paper específic de l'EO i els seus compostos aïllats (sols o en combinació) en els mecanismes sinèrgics.
El 1977, es van reportar nivells creixents de resistència a la permetrina en les principals poblacions de vectors a Tailàndia, i durant les dècades següents, l'ús de la permetrina va ser substituït en gran mesura per altres productes químics piretroides, especialment els substituïts per la deltametrina [82]. Tanmateix, la resistència dels vectors a la deltametrina i altres classes d'insecticides és extremadament comuna a tot el país a causa de l'ús excessiu i persistent [14, 17, 83, 84, 85, 86]. Per combatre aquest problema, es recomana rotar o reutilitzar els pesticides descartats que anteriorment eren eficaços i menys tòxics per als mamífers, com la permetrina. Actualment, tot i que l'ús de la permetrina s'ha reduït en els programes recents de control de mosquits del govern nacional, encara es pot trobar resistència a la permetrina en les poblacions de mosquits. Això pot ser degut a l'exposició dels mosquits a productes comercials de control de plagues domèstics, que consisteixen principalment en permetrina i altres piretroides [14, 17]. Per tant, la reutilització amb èxit de la permetrina requereix el desenvolupament i la implementació d'estratègies per reduir la resistència dels vectors. Tot i que cap dels olis essencials provats individualment en aquest estudi va ser tan eficaç com la permetrina, treballar conjuntament amb la permetrina va donar lloc a efectes sinèrgics impressionants. Això és un indici prometedor que la interacció de l'AE amb els mecanismes de resistència fa que la combinació de la permetrina amb l'AE sigui més eficaç que l'insecticida o l'AE sols, particularment contra el PMD-R Ae. Aedes aegypti. Els beneficis de les mescles sinèrgiques per augmentar l'eficàcia, malgrat l'ús de dosis més baixes per al control de vectors, poden conduir a una millor gestió de la resistència i a una reducció de costos [33, 87]. A partir d'aquests resultats, és agradable observar que els AE d'A. galanga i C. rotundus van ser significativament més eficaços que el PBO en la sinergització de la toxicitat de la permetrina tant en les soques MCM-S com PMD-R i són una alternativa potencial als ajuts ergogènics tradicionals.
Els OE seleccionats van tenir efectes sinèrgics significatius en la millora de la toxicitat en adults contra el PMD-R Ae. aegypti, especialment l'oli de galangal, té un valor SR de fins a 1233,33, cosa que indica que els OE tenen un ampli potencial com a sinergitzant per millorar l'eficàcia de la permetrina. Això pot estimular l'ús d'un nou producte natural actiu, que en conjunt podria augmentar l'ús de productes altament eficaços per al control de mosquits. També revela el potencial de l'òxid d'etilè com a sinergitzant alternatiu per millorar eficaçment els insecticides antics o tradicionals per abordar els problemes de resistència existents en les poblacions de mosquits. L'ús de plantes fàcilment disponibles en els programes de control de mosquits no només redueix la dependència de materials importats i cars, sinó que també estimula els esforços locals per enfortir els sistemes de salut pública.
Aquests resultats mostren clarament l'efecte sinèrgic significatiu produït per la combinació d'òxid d'etilè i permetrina. Els resultats destaquen el potencial de l'òxid d'etilè com a sinergista vegetal en el control de mosquits, augmentant l'eficàcia de la permetrina contra els mosquits, especialment en poblacions resistents. Els desenvolupaments i la recerca futurs requeriran bioanàlisi sinèrgica dels olis de galangal i alpinia i els seus compostos aïllats, combinacions d'insecticides d'origen natural o sintètic contra múltiples espècies i estadis de mosquits, i proves de toxicitat contra organismes no objectiu. Ús pràctic de l'òxid d'etilè com a sinergista alternatiu viable.
Organització Mundial de la Salut. Estratègia mundial per a la prevenció i el control del dengue 2012–2020. Ginebra: Organització Mundial de la Salut, 2012.
Weaver SC, Costa F., Garcia-Blanco MA, Ko AI, Ribeiro GS, Saade G., et al. Virus del Zika: història, aparició, biologia i perspectives de control. Investigació antiviral. 2016;130:69–80.
Organització Mundial de la Salut. Fitxa informativa sobre el dengue. 2016. http://www.searo.who.int/entity/vector_borne_tropical_diseases/data/data_factsheet/en/. Data de consulta: 20 de gener de 2017.
Departament de Salut Pública. Estat actual dels casos de febre del dengue i febre hemorràgica del dengue a Tailàndia. 2016. http://www.m-society.go.th/article_attach/13996/17856.pdf. Data de consulta: 6 de gener de 2017.
Ooi EE, Goh CT, Gabler DJ. 35 anys de prevenció del dengue i control de vectors a Singapur. Malaltia infecciosa sobtada. 2006;12:887–93.
Morrison AC, Zielinski-Gutierrez E, Scott TW, Rosenberg R. Identificar els reptes i proposar solucions per controlar els vectors virals Aedes aegypti. PLOS Medicine. 2008;5:362–6.
Centres per al Control i la Prevenció de Malalties. Febre del dengue, entomologia i ecologia. 2016. http://www.cdc.gov/dengue/entomologyecology/. Data de consulta: 6 de gener de 2017
Ohimain EI, Angaye TKN, Bassey SE Comparació de l'activitat larvicida de fulles, escorça, tiges i arrels de Jatropa curcas (Euphorbiaceae) contra el vector de la malària Anopheles gambiae. SZhBR. 2014;3:29-32.
Soleimani-Ahmadi M, Watandoust H, Zareh M. Característiques de l'hàbitat de les larves d'Anopheles a les zones de malària del programa d'eradicació de la malària al sud-est de l'Iran. Asia Pacific J Trop Biomed. 2014;4(Suppl 1):S73–80.
Bellini R, Zeller H, Van Bortel W. Revisió dels enfocaments per al control de vectors, la prevenció i el control dels brots del virus del Nil Occidental i els reptes als quals s'enfronta Europa. Paràsits vectors. 2014;7:323.
Muthusamy R., Shivakumar MS Selecció i mecanismes moleculars de resistència a la cipermetrina en erugues vermelles (Amsacta albistriga Walker). Fisiologia bioquímica de les plagues. 2014;117:54–61.
Ramkumar G., Shivakumar MS Estudi de laboratori de la resistència a la permetrina i la resistència creuada de Culex quinquefasciatus a altres insecticides. Palastor Research Center. 2015;114:2553–60.
Matsunaka S, Hutson DH, Murphy SD. Química dels pesticides: benestar humà i medi ambient, vol. 3: Mecanisme d'acció, metabolisme i toxicologia. Nova York: Pergamon Press, 1983.
Chareonviriyaphap T, Bangs MJ, Souvonkert V, Kongmi M, Korbel AV, Ngoen-Klan R. Una revisió de la resistència als insecticides i l'evitació conductual dels vectors de malalties humanes a Tailàndia. Paràsits vector. 2013;6:280.
Chareonviriyaphap T, Aum-Aung B, Ratanatham S. Patrons actuals de resistència als insecticides entre els vectors de mosquits a Tailàndia. Southeast Asia J Trop Med Public Health. 1999;30:184-94.
Chareonviriyaphap T, Bangs MJ, Ratanatham S. Estat de la malària a Tailàndia. Southeast Asia J Trop Med Public Health. 2000;31:225–37.
Plernsub S, Saingamsuk J, Yanola J, Lumjuan N, Thippavankosol P, Walton S, Somboon P. Freqüència temporal de les mutacions de resistència a la inactivació F1534C i V1016G en mosquits Aedes aegypti a Chiang Mai, Tailàndia, i l'impacte de les mutacions en l'eficiència dels polvoritzadors de boira tèrmica que contenen piretroides. Aktatrop. 2016;162:125–32.
Vontas J, Kioulos E, Pavlidi N, Moru E, Della Torre A, Ranson H. Insecticide resistance in the main dengue vectors Aedes albopictus and Aedes aegypti. Fisiologia bioquímica de les plagues. 2012;104:126–31.
Data de publicació: 08 de juliol de 2024