El fàrmac antihelmíntic N,N-dietil-m-toluamida (DEET) s'ha informat que inhibeix l'AChE (acetilcolinesterasa) i té propietats cancerígenes potencials a causa d'una vascularització excessiva. En aquest article, mostrem que el DEET estimula específicament les cèl·lules endotelials que promouen l'angiogènesi, augmentant així el creixement del tumor. El DEET activa els processos cel·lulars que condueixen a l'angiogènesi, incloent la proliferació, la migració i l'adhesió. Això s'associa amb l'augment de la producció de NO i l'expressió de VEGF a les cèl·lules endotelials. El silenci de M3 o l'ús d'inhibidors farmacològics de M3 va abolir tots aquests efectes, cosa que suggereix que l'angiogènesi induïda per DEET és sensible a M3. Els experiments que impliquen senyalització de calci en cèl·lules endotelials i HEK que sobreexpressen receptors M3, així com estudis d'unió i acoblament, indiquen que el DEET actua com un modulador al·lostèric dels receptors M3. A més, el DEET inhibeix l'AChE, augmentant així la biodisponibilitat de l'acetilcolina i la seva unió als receptors M3, i millorant els efectes proangiogènics mitjançant la regulació al·lostèrica.
Els EC primaris es van aïllar de l'aorta de ratolins suïssos. El mètode d'extracció es va adaptar del protocol Kobayashi 26 . Els EC murins es van cultivar en medi EBM-2 suplementat amb un 5% de FBS inactivat per calor fins al quart passatge.
L'efecte de dues concentracions de DEET sobre la proliferació de HUVEC, U87MG o BF16F10 es va analitzar mitjançant el CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Breument, es van sembrar 5, 103 cèl·lules per pou en una placa de 96 pous, es van deixar connectar durant la nit i després es van tractar amb DEET durant 24 h. Després d'eliminar el medi de creixement, afegiu la solució d'unió del colorant a cada pou de la microplaca i incubeu les cèl·lules a 37 ° C durant 30 min. Els nivells de fluorescència es van determinar mitjançant un lector de microplaques multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanya) equipat amb filtres d'excitació de 485 nm i filtres d'emissió de 530 nm.
Els HUVEC es van sembrar en plaques de 96 pous a una densitat de 104 cèl·lules per pou. Les cèl·lules es van tractar amb DEET durant 24 h. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant un assaig colorimètric MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Els valors de densitat òptica es van obtenir en un lector de microplaques multimode (Mithras LB940) a una longitud d'ona de 570 nm.
Els efectes del DEET es van estudiar mitjançant assajos d'angiogènesi in vitro. El tractament amb DEET de 10-8 M o 10-5 M va augmentar la formació de longitud capil·lar en els HUVEC (Fig. 1a, b, barres blanques). En comparació amb el grup control, el tractament amb concentracions de DEET que oscil·laven entre 10-14 i 10-5 M va mostrar que la longitud del capil·lar va assolir un altiplà a 10-8 M DEET (figura suplementària S2). No es va trobar cap diferència significativa en l'efecte proangiogènic in vitro dels HUVEC tractats amb DEET en el rang de concentració de 10-8 M i 10-5 M.
Per determinar l'efecte del DEET sobre la neovascularització, vam realitzar estudis de neovascularització in vivo. Després de 14 dies, els ratolins injectats amb cèl·lules endotelials precultivades amb DEET 10-8 M o 10-5 M van mostrar un augment significatiu del contingut d'hemoglobina (Fig. 1c, barres blanques).
A més, es va estudiar la neovascularització induïda per DEET en ratolins portadors de xenograft U87MG que es van injectar diàriament (ip) amb DEET a una dosi coneguda per induir concentracions plasmàtiques de 10-5 M, que és normal en humans exposats. a 23. Es van observar tumors detectables (és a dir, tumors >100 mm3) 14 dies després de la injecció de cèl·lules U87MG als ratolins. El dia 28, el creixement del tumor es va millorar significativament en els ratolins tractats amb DEET en comparació amb els ratolins control (Fig. 1d, quadrats). A més, la tinció de CD31 dels tumors va demostrar que el DEET va augmentar significativament l'àrea capil·lar però no la densitat de microvasos. (Fig. 1e–g).
Per determinar el paper dels receptors muscarínics en la proliferació induïda per DETA, es va utilitzar 10-8 M o 10-5 M DETA en presència de pFHHSiD (10-7 M, un antagonista selectiu del receptor M3). Tractament de HUVEC. pFHHSiD va bloquejar completament les propietats proliferatives de DETA a totes les concentracions (taula 1).
En aquestes condicions, també vam examinar si el DEET augmentaria la longitud capil·lar a les cèl·lules HUVEC. De la mateixa manera, pFHHSiD va prevenir significativament la longitud capil·lar induïda per DEET (Fig. 1a, b, barres grises). A més, es van realitzar experiments similars amb siRNA M3. Tot i que el siRNA de control no va ser eficaç per promoure la formació capil·lar, el silenciament del receptor muscarínic M3 va abolir la capacitat del DEET per augmentar la longitud del capil·lar (Fig. 1a, b, barres negres).
A més, tant la vascularització induïda per DEET 10-8 M o 10-5 M in vitro com la neovascularització in vivo van ser completament bloquejades per pFHHSiD (Fig. 1c, d, cercles). Aquests resultats indiquen que el DEET promou l'angiogènesi mitjançant una via sensible als antagonistes selectius del receptor M3 o siRNA M3.
L'AChE és l'objectiu molecular del DEET. Fàrmacs com el donepezil, que actuen com a inhibidors de l'AChE, poden estimular l'angiogènesi EC in vitro i en models d'isquèmia de extremitats posteriors de ratolí14. Hem provat l'efecte de dues concentracions de DEET sobre l'activitat de l'enzim AChE a HUVEC. Les concentracions baixes (10-8 M) i altes (10-5 M) de DEET van disminuir l'activitat de l'AChE endotelial en comparació amb les condicions de control (Fig. 2).
Ambdues concentracions de DEET (10-8 M i 10-5 M) van reduir l'activitat de l'acetilcolinesterasa a HUVEC. BW284c51 (10-5 M) es va utilitzar com a control dels inhibidors de l'acetilcolinesterasa. Els resultats s'expressen com a percentatge d'activitat d'AChE en HUVEC tractat amb les dues concentracions de DEET en comparació amb cèl·lules tractades amb vehicles. Els valors s'expressen com a mitjana ± SEM de sis experiments independents. *p <0,05 en comparació amb el control (test de comparació múltiple de Kruskal-Wallis i Dunn).
L'òxid nítric (NO) està implicat en el procés angiogènic 33, per tant, es va estudiar la producció de NO en els HUVEC estimulats per DEET. La producció de NO endotelial tractada amb DEET va augmentar en comparació amb les cèl·lules de control, però va assolir significació només a una dosi de 10-8 M (Fig. 3c). Per determinar els canvis moleculars que controlen la producció de NO induïda per DEET, es van analitzar l'expressió i l'activació d'eNOS mitjançant Western blotting. Tot i que el tractament amb DEET no va alterar l'expressió d'eNOS, va augmentar significativament la fosforilació d'eNOS al seu lloc d'activació (Ser-1177) alhora que va disminuir el seu lloc inhibidor (Thr-495) en comparació amb les cèl·lules no tractades en la fosforilació d'eNOS (Fig. 3d). A més, es va calcular la proporció d'eNOS fosforilada al lloc d'activació i al lloc inhibidor després de normalitzar la quantitat d'eNOS fosforilada a la quantitat total d'enzim. Aquesta proporció es va incrementar significativament en els HUVEC tractats amb cada concentració de DEET en comparació amb les cèl·lules no tractades (Fig. 3d).
Finalment, es va analitzar l'expressió de VEGF, un dels principals factors proangiogènics, mitjançant Western blotting. DEET va augmentar significativament l'expressió de VEGF, mentre que pFHHSiD va bloquejar completament aquesta expressió.
Com que els efectes del DEET són sensibles tant al bloqueig farmacològic com a la baixada dels receptors M3, vam provar la hipòtesi que el DEET podria millorar la senyalització del calci. Sorprenentment, el DEET no va augmentar el calci citoplasmàtic a HUVEC (dades no mostrades) i HEK/M3 (Fig. 4a, b) per a ambdues concentracions utilitzades.
Hora de publicació: 30-12-2024