En aquest estudi, els efectes estimulants del tractament combinat dereguladors del creixement de les plantes(2,4-D i cinetina) i nanopartícules d'òxid de ferro (Fe₃O₄-NPs) sobre la morfogènesi in vitro i la producció de metabòlits secundaris en *Hypericum perforatum* L. Es va investigar el tractament optimitzat [2,4-D (0,5 mg/L) + cinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] va millorar significativament els paràmetres de creixement de la planta: l'alçada de la planta va augmentar un 59,6%, la longitud de l'arrel un 114,0%, el nombre de brots un 180,0% i el pes fresc del call un 198,3% en comparació amb el grup de control. Aquest tractament combinat també va millorar l'eficiència de regeneració (50,85%) i va augmentar el contingut d'hipericina un 66,6%. L'anàlisi GC-MS va revelar un alt contingut d'hiperosid, β-patolè i alcohol cetílic, que representa el 93,36% de l'àrea total del pic, mentre que el contingut de fenòlics i flavonoides totals va augmentar fins a un 80,1%. Aquests resultats indiquen que els reguladors del creixement vegetal (PGR) i les nanopartícules de Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) exerceixen un efecte sinèrgic estimulant l'organogènesi i l'acumulació de compostos bioactius, la qual cosa representa una estratègia prometedora per a la millora biotecnològica de les plantes medicinals.
L'herba de Sant Joan (Hypericum perforatum L.), també coneguda com a herba de Sant Joan, és una planta herbàcia perenne de la família de les hipericàcies que té valor econòmic.[1] Els seus components bioactius potencials inclouen tanins naturals, xantones, floroglucinol, naftalenodiantrona (hiperina i pseudohiperina), flavonoides, àcids fenòlics i olis essencials.[2,3,4] L'herba de Sant Joan es pot propagar per mètodes tradicionals; tanmateix, l'estacionalitat dels mètodes tradicionals, la baixa germinació de les llavors i la susceptibilitat a les malalties limiten el seu potencial per al cultiu a gran escala i la formació contínua de metabòlits secundaris.[1,5,6]
Així doncs, el cultiu de teixits in vitro es considera un mètode eficaç per a la propagació ràpida de plantes, la conservació dels recursos de germoplasma i l'augment del rendiment de compostos medicinals [7, 8]. Els reguladors del creixement vegetal (PGR) tenen un paper crucial en la regulació de la morfogènesi i són necessaris per al cultiu in vitro de calls i organismes sencers. L'optimització de les seves concentracions i combinacions és crucial per a la realització amb èxit d'aquests processos de desenvolupament [9]. Per tant, comprendre la composició i la concentració adequades dels reguladors és important per millorar el creixement i la capacitat regenerativa de l'herba de Sant Joan (H. perforatum) [10].
Les nanopartícules d'òxid de ferro (Fe₃O₄) són una classe de nanopartícules que s'han desenvolupat o s'estan desenvolupant per al cultiu de teixits. El Fe₃O₄ té propietats magnètiques significatives, bona biocompatibilitat i la capacitat de promoure el creixement de les plantes i reduir l'estrès ambiental, per la qual cosa ha atret una atenció considerable en els dissenys de cultius de teixits. Les aplicacions potencials d'aquestes nanopartícules poden incloure l'optimització del cultiu in vitro per promoure la divisió cel·lular, millorar l'absorció de nutrients i activar enzims antioxidants [11].
Tot i que les nanopartícules han demostrat bons efectes promotors del creixement de les plantes, els estudis sobre l'aplicació combinada de nanopartícules de Fe₃O₄ i reguladors del creixement vegetal optimitzats en *H. perforatum* continuen sent escassos. Per omplir aquesta bretxa de coneixement, aquest estudi va avaluar els efectes dels seus efectes combinats sobre la morfogènesi in vitro i la producció de metabòlits secundaris per proporcionar nous coneixements per millorar les característiques de les plantes medicinals. Per tant, aquest estudi té dos objectius: (1) optimitzar la concentració de reguladors del creixement vegetal per promoure eficaçment la formació de calls, la regeneració de brots i l'arrelament in vitro; i (2) avaluar els efectes de les nanopartícules de Fe₃O₄ sobre els paràmetres de creixement in vitro. Els plans futurs inclouen l'avaluació de la taxa de supervivència de les plantes regenerades durant l'aclimatació (in vitro). S'espera que els resultats d'aquest estudi millorin significativament l'eficiència de micropropagació de *H. perforatum*, contribuint així a l'ús sostenible i les aplicacions biotecnològiques d'aquesta important planta medicinal.
En aquest estudi, vam obtenir explants de fulles de plantes anuals d'herba de Sant Joan (plantes mare) cultivades al camp. Aquests explants es van utilitzar per optimitzar les condicions de cultiu in vitro. Abans del cultiu, les fulles es van esbandir a fons amb aigua destil·lada corrent durant diversos minuts. A continuació, es van desinfectar les superfícies dels explants immersant-les en etanol al 70% durant 30 segons, seguit d'immersió en una solució d'hipoclorit de sodi (NaOCl) a l'1,5% que contenia unes gotes de Tween 20 durant 10 minuts. Finalment, els explants es van esbandir tres vegades amb aigua destil·lada estèril abans de transferir-los al següent medi de cultiu.
Durant les quatre setmanes següents, es van mesurar els paràmetres de regeneració dels brots, incloent-hi la taxa de regeneració, el nombre de brots per explant i la longitud dels brots. Quan els brots regenerats van assolir una longitud d'almenys 2 cm, es van transferir a un medi d'arrelament que consistia en un medi MS a la meitat de la concentració, 0,5 mg/L d'àcid indolebutíric (IBA) i un 0,3% de goma guar. El cultiu d'arrelament va continuar durant tres setmanes, durant les quals es van mesurar la taxa d'arrelament, el nombre d'arrels i la longitud de les arrels. Cada tractament es va repetir tres vegades, amb 10 explants cultivats per rèplica, donant aproximadament 30 explants per tractament.
L'alçada de la planta es va mesurar en centímetres (cm) amb un regle, des de la base de la planta fins a la punta de la fulla més alta. La longitud de l'arrel es va mesurar en mil·límetres (mm) immediatament després de treure amb cura les plàntules i el medi de cultiu. El nombre de brots per explant es va comptar directament a cada planta. El nombre de taques negres a les fulles, conegudes com a nòduls, es va mesurar visualment. Es creu que aquests nòduls negres són glàndules que contenen hipericina, o taques oxidatives, i s'utilitzen com a indicador fisiològic de la resposta de la planta al tractament. Després de treure tot el medi de cultiu, es va mesurar el pes fresc de les plàntules amb una balança electrònica amb una precisió de mil·ligrams (mg).
El mètode per calcular la taxa de formació de callus és el següent: després de cultivar explants en un medi que conté diversos reguladors de creixement (cinases, 2,4-D i Fe3O4) durant quatre setmanes, es compta el nombre d'explants capaços de formar callus. La fórmula per calcular la taxa de formació de callus és la següent:
Cada tractament es va repetir tres vegades, amb almenys 10 explants examinats en cada repetició.
La taxa de regeneració reflecteix la proporció de teixit cal·lus que completa amb èxit el procés de diferenciació de brots després de l'etapa de formació del call. Aquest indicador demostra la capacitat del teixit cal·lus per transformar-se en teixit diferenciat i créixer en nous òrgans vegetals.
El coeficient d'arrelament és la relació entre el nombre de branques capaces d'arrelar i el nombre total de branques. Aquest indicador reflecteix l'èxit de la fase d'arrelament, que és crucial en la micropropagació i la propagació de les plantes, ja que un bon arrelament ajuda a les plàntules a sobreviure millor en condicions de creixement.
Els compostos d'hipericina es van extreure amb metanol al 90%. Es van afegir cinquanta mg de material vegetal sec a 1 ml de metanol i es va sonicar durant 20 min a 30 kHz en un netejador ultrasònic (model A5120-3YJ) a temperatura ambient i a les fosques. Després de la sonicació, la mostra es va centrifugar a 6000 rpm durant 15 min. Es va recollir el sobrenedant i es va mesurar l'absorbància d'hipericina a 592 nm utilitzant un espectrofotòmetre Plus-3000 S segons el mètode descrit per Conceiçao et al. [14].
La majoria dels tractaments amb reguladors del creixement vegetal (PGR) i nanopartícules d'òxid de ferro (Fe₃O₄-NPs) no van induir la formació de nòduls negres a les fulles regenerades dels brots. No es van observar nòduls en cap dels tractaments amb 0,5 o 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 o 1 mg/L de cinetina, o 1, 2 o 4 mg/L de nanopartícules d'òxid de ferro. Algunes combinacions van mostrar un lleuger augment en el desenvolupament de nòduls (però no estadísticament significatiu) a concentracions més altes de cinetina i/o nanopartícules d'òxid de ferro, com ara la combinació de 2,4-D (0,5–2 mg/L) amb cinetina (1–1,5 mg/L) i nanopartícules d'òxid de ferro (2–4 mg/L). Aquests resultats es mostren a la Figura 2. Els nòduls negres representen glàndules riques en hipericina, tant d'origen natural com beneficioses. En aquest estudi, els nòduls negres es van associar principalment amb l'enfosquiment dels teixits, cosa que indica un entorn favorable per a l'acumulació d'hipericina. El tractament amb nanopartícules de 2,4-D, cinetina i Fe₃O₄ va promoure el creixement del call, va reduir l'enfosquiment i va augmentar el contingut de clorofil·la, cosa que suggereix una millor funció metabòlica i una possible reducció del dany oxidatiu [37]. Aquest estudi va avaluar els efectes de la cinetina en combinació amb nanopartícules de 2,4-D i Fe₃O₄ sobre el creixement i desenvolupament del call de l'herba de Sant Joan (Fig. 3a-g). Estudis anteriors han demostrat que les nanopartícules de Fe₃O₄ tenen activitats antifúngiques i antimicrobianes [38, 39] i, quan s'utilitzen en combinació amb reguladors del creixement vegetal, poden estimular els mecanismes de defensa de les plantes i reduir els índexs d'estrès cel·lular [18]. Tot i que la biosíntesi de metabòlits secundaris està regulada genèticament, el seu rendiment real depèn en gran mesura de les condicions ambientals. Els canvis metabòlics i morfològics poden influir en els nivells de metabòlits secundaris regulant l'expressió de gens vegetals específics i responent a factors ambientals. A més, els inductors poden desencadenar l'activació de nous gens, que al seu torn estimulen l'activitat enzimàtica, activant finalment múltiples vies biosintètiques i conduint a la formació de metabòlits secundaris. A més, un altre estudi va demostrar que la reducció de l'ombra augmenta l'exposició a la llum solar, augmentant així les temperatures diürnes a l'hàbitat natural de *Hypericum perforatum*, cosa que també contribueix a augmentar el rendiment d'hipericina. Basant-se en aquestes dades, aquest estudi va investigar el paper de les nanopartícules de ferro com a possibles inductors en el cultiu de teixits. Els resultats van mostrar que aquestes nanopartícules poden activar gens implicats en la biosíntesi d'hesperidina mitjançant l'estimulació enzimàtica, cosa que provoca una major acumulació d'aquest compost (Fig. 2). Per tant, en comparació amb les plantes que creixen en condicions naturals, es pot argumentar que la producció d'aquests compostos in vivo també es pot millorar quan es combina un estrès moderat amb l'activació de gens implicats en la biosíntesi de metabòlits secundaris. Els tractaments combinats generalment tenen un efecte positiu sobre la taxa de regeneració, però en alguns casos, aquest efecte es debilita. Cal destacar que el tractament amb 1 mg/L de 2,4-D, 1,5 mg/L de cinasa i diferents concentracions podria augmentar de manera independent i significativa la taxa de regeneració en un 50,85% en comparació amb el grup de control (Fig. 4c). Aquests resultats suggereixen que combinacions específiques de nanohormones poden actuar sinèrgicament per promoure el creixement de les plantes i la producció de metabòlits, cosa que és de gran importància per al cultiu de teixits de plantes medicinals. Palmer i Keller [50] van demostrar que el tractament amb 2,4-D podia induir independentment la formació de calls a St. perforatum, mentre que l'addició de cinasa millorava significativament la formació i la regeneració de calls. Aquest efecte es devia a la millora de l'equilibri hormonal i l'estimulació de la divisió cel·lular. Bal et al. [51] van trobar que el tractament amb Fe₃O₄-NP podia millorar independentment la funció dels enzims antioxidants, promovent així el creixement de les arrels a St. perforatum. Els medis de cultiu que contenien nanopartícules de Fe₃O₄ a concentracions de 0,5 mg/L, 1 mg/L i 1,5 mg/L van millorar la taxa de regeneració de les plantes de lli [52]. L'ús de cinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinona i nanopartícules de Fe₃O₄ va millorar significativament les taxes de formació de calls i arrels, però cal tenir en compte els possibles efectes secundaris de l'ús d'aquestes hormones per a la regeneració in vitro. Per exemple, l'ús a llarg termini o en concentracions elevades de 2,4-diclorobenzotiazolinona o cinetina pot provocar variació clonal somàtica, estrès oxidatiu, morfologia anormal del call o vitrificació. Per tant, una taxa de regeneració alta no necessàriament prediu estabilitat genètica. Totes les plantes regenerades s'han d'avaluar mitjançant marcadors moleculars (per exemple, RAPD, ISSR, AFLP) o anàlisi citogenètica per determinar la seva homogeneïtat i similitud amb les plantes in vivo [53,54,55].
Aquest estudi va demostrar per primera vegada que l'ús combinat de reguladors del creixement vegetal (2,4-D i cinetina) amb nanopartícules de Fe₃O₄ pot millorar la morfogènesi i l'acumulació de metabòlits bioactius clau (inclosa la hipericina i l'hiperòsid) en *Hypericum perforatum*. El règim de tractament optimitzat (1 mg/L de 2,4-D + 1 mg/L de cinetina + 4 mg/L de Fe₃O₄-NPs) no només va maximitzar la formació de calls, l'organogènesi i el rendiment de metabòlits secundaris, sinó que també va demostrar un lleuger efecte inductor, millorant potencialment la tolerància a l'estrès i el valor medicinal de la planta. La combinació de nanotecnologia i cultiu de teixits vegetals proporciona una plataforma sostenible i eficient per a la producció in vitro a gran escala de compostos medicinals. Aquests resultats obren el camí per a aplicacions industrials i futures investigacions sobre mecanismes moleculars, optimització de la dosi i precisió genètica, vinculant així la investigació fonamental sobre plantes medicinals amb la biotecnologia pràctica.
Data de publicació: 12 de desembre de 2025