El creixement del meristema apical de la tija (SAM) és crític per a l'arquitectura de la tija. Hormones vegetalsgiberel·linesEls GA (agents gàstrics) tenen un paper clau en la coordinació del creixement de les plantes, però el seu paper en el SAM encara no es coneix gaire. Aquí, hem desenvolupat un biosensor ratiomètric de la senyalització GA mitjançant l'enginyeria de la proteïna DELLA per suprimir la seva funció reguladora essencial en la resposta transcripcional de GA alhora que preserva la seva degradació després del reconeixement de GA. Demostrem que aquest biosensor basat en la degradació registra amb precisió els canvis en els nivells de GA i la detecció cel·lular durant el desenvolupament. Hem utilitzat aquest biosensor per cartografiar l'activitat de senyalització GA en el SAM. Mostrem que els senyals GA alts són presents predominantment en cèl·lules situades entre els primordis d'òrgans, que són precursors de les cèl·lules internodals. Mitjançant enfocaments de guany i pèrdua de funció, demostrem a més que GA regula l'orientació del pla de divisió cel·lular, establint l'organització cel·lular canònica dels internodals, promovent així l'especificació internodal en el SAM.
El meristem apical de la tija (SAM), situat a l'àpex de la tija, conté un nínxol de cèl·lules mare l'activitat de les quals genera òrgans laterals i nodes de la tija de manera modular i iterativa al llarg de la vida de la planta. Cadascuna d'aquestes unitats repetitives, o nodes de la planta, inclou internodes i òrgans laterals als nodes, i meristemes axil·lars a les axil·les de les fulles1. El creixement i l'organització dels nodes de la planta canvien durant el desenvolupament. A Arabidopsis, el creixement internodal es suprimeix durant l'etapa vegetativa i els meristemes axil·lars romanen latents a les axil·les de les fulles de la roseta. Durant la transició a la fase floral, el SAM es converteix en el meristem de la inflorescència, generant internodes allargats i brots axil·lars, branquetes a les axil·les de les fulles caulinars i, més tard, flors sense fulles2. Tot i que hem fet progressos significatius en la comprensió dels mecanismes que controlen la iniciació de fulles, flors i branques, se sap relativament poc sobre com sorgeixen els internodes.
Comprendre la distribució espaciotemporal dels GA ajudarà a entendre millor les funcions d'aquestes hormones en diferents teixits i en diferents etapes de desenvolupament. La visualització de la degradació de la fusió RGA-GFP expressada sota l'acció del seu propi promotor proporciona informació important sobre la regulació dels nivells totals de GA a les arrels15,16. Tanmateix, l'expressió de RGA varia entre els teixits17 i està regulada per GA18. Per tant, l'expressió diferencial del promotor RGA pot donar lloc al patró de fluorescència observat amb RGA-GFP i, per tant, aquest mètode no és quantitatiu. Més recentment, GA19,20 marcat amb fluoresceïna bioactiva (Fl) va revelar l'acumulació de GA a l'endocòrtex de l'arrel i la regulació dels seus nivells cel·lulars mitjançant el transport de GA. Recentment, el sensor GA FRET nlsGPS1 va mostrar que els nivells de GA es correlacionen amb l'elongació cel·lular en arrels, filaments i hipocòtils de creixement fosc21. Tanmateix, com hem vist, la concentració de GA no és l'únic paràmetre que controla l'activitat de senyalització de GA, ja que depèn de processos de detecció complexos. Aquí, basant-nos en el nostre coneixement de les vies de senyalització DELLA i GA, informem del desenvolupament i la caracterització d'un biosensor ratiomètric basat en la degradació per a la senyalització GA. Per desenvolupar aquest biosensor quantitatiu, vam utilitzar un RGA mutant sensible a GA que es va fusionar a una proteïna fluorescent i s'expressa ubicuament en els teixits, així com una proteïna fluorescent insensible a GA. Mostrem que les fusions de proteïnes RGA mutants no interfereixen amb la senyalització GA endògena quan s'expressen ubicuament, i que aquest biosensor pot quantificar l'activitat de senyalització resultant tant de l'entrada de GA com del processament del senyal GA per part de l'aparell sensor amb una alta resolució espaciotemporal. Vam utilitzar aquest biosensor per cartografiar la distribució espaciotemporal de l'activitat de senyalització GA i quantificar com GA regula el comportament cel·lular a l'epidermis SAM. Demostrem que GA regula l'orientació del pla de divisió de les cèl·lules SAM situades entre els primordis d'òrgans, definint així l'organització cel·lular canònica de l'internod.
Finalment, ens vam preguntar si qmRGA podia informar de canvis en els nivells endògens de GA utilitzant hipocòtils en creixement. Anteriorment vam demostrar que el nitrat estimula el creixement augmentant la síntesi de GA i, al seu torn, la degradació de DELLA34. En conseqüència, vam observar que la longitud de l'hipocòtil en les plàntules pUBQ10::qmRGA cultivades sota un subministrament abundant de nitrat (10 mM NO3−) era significativament més llarga que la de les plàntules cultivades en condicions de deficiència de nitrat (Fig. suplementària 6a). D'acord amb la resposta de creixement, els senyals de GA eren més alts en els hipocòtils de les plàntules cultivades en condicions de 10 mM NO3− que en les plàntules cultivades en absència de nitrat (Fig. suplementària 6b, c). Per tant, qmRGA també permet monitoritzar els canvis en la senyalització de GA induïts per canvis endògens en la concentració de GA.
Per entendre si l'activitat de senyalització GA detectada per qmRGA depèn de la concentració de GA i la percepció de GA, tal com s'esperava segons el disseny del sensor, vam analitzar l'expressió dels tres receptors GID1 en teixits vegetatius i reproductius. En plàntules, la línia reportera GID1-GUS va mostrar que GID1a i c estaven altament expressats en cotilèdons (Fig. 3a-c). A més, els tres receptors s'expressaven en fulles, primordis d'arrels laterals, puntes d'arrel (excepte la calota radicular de GID1b) i el sistema vascular (Fig. 3a-c). A la SAM d'inflorescència, vam detectar senyals GUS només per a GID1b i 1c (Fig. suplementària 7a-c). La hibridació in situ va confirmar aquests patrons d'expressió i va demostrar a més que GID1c s'expressava uniformement a nivells baixos a la SAM, mentre que GID1b mostrava una expressió més alta a la perifèria de la SAM (Fig. suplementària 7d-l). La fusió translacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b també va revelar un rang gradual d'expressió de GID1b, des de baixa o nul·la expressió al centre del SAM fins a alta expressió a les vores dels òrgans (Fig. suplementària 7m). Per tant, els receptors GID1 no es distribueixen uniformement a través i dins dels teixits. En experiments posteriors, també vam observar que la sobreexpressió de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) augmentava la sensibilitat de qmRGA en hipocòtils a l'aplicació externa de GA (Fig. 3d, e). En canvi, la fluorescència mesurada per qd17mRGA a l'hipocòtil era insensible al tractament amb GA3 (Fig. 3f, g). Per a ambdós assaigs, les plàntules es van tractar amb altes concentracions de GA (100 μM GA3) per avaluar el comportament ràpid del sensor, on la capacitat d'unir-se al receptor GID1 es va millorar o perdre. Junts, aquests resultats confirmen que el biosensor qmRGA té una funció combinada com a sensor GA i GA, i suggereixen que l'expressió diferencial del receptor GID1 pot modular significativament l'emissivitat del sensor.
Fins ara, la distribució dels senyals GA al SAM continua sense estar clara. Per tant, vam utilitzar plantes que expressen qmRGA i el reporter de cèl·lules mare pCLV3::mCherry-NLS35 per calcular mapes quantitatius d'alta resolució de l'activitat de senyalització GA, centrant-nos en la capa L1 (epidermis; Fig. 4a, b, vegeu Mètodes i Mètodes Suplementaris), ja que L1 juga un paper clau en el control del creixement del SAM36. Aquí, l'expressió pCLV3::mCherry-NLS va proporcionar un punt de referència geomètric fix per analitzar la distribució espaciotemporal de l'activitat de senyalització GA37. Tot i que el GA es considera essencial per al desenvolupament lateral dels òrgans4, vam observar que els senyals GA eren baixos en el primordi floral (P) a partir de l'etapa P3 (Fig. 4a, b), mentre que els primordis joves P1 i P2 tenien una activitat moderada similar a la de la regió central (Fig. 4a, b). Es va detectar una activitat de senyalització GA més alta als límits dels primordis de l'òrgan, començant a P1/P2 (als costats del límit) i arribant al màxim a P4, així com a totes les cèl·lules de la regió perifèrica situada entre els primordis (Fig. 4a, b i Fig. suplementària 8a, b). Aquesta activitat de senyalització GA més alta es va observar no només a l'epidermis, sinó també a les capes L2 i L3 superior (Fig. suplementària 8b). El patró de senyals GA detectats al SAM mitjançant qmRGA també es va mantenir sense canvis al llarg del temps (Fig. suplementària 8c-f, k). Tot i que la construcció qd17mRGA es va regular a la baixa sistemàticament al SAM de plantes T3 de cinc línies independents que vam caracteritzar en detall, vam poder analitzar els patrons de fluorescència obtinguts amb la construcció pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. suplementària 8g-j, l). En aquesta línia de control, només es van detectar canvis menors en la relació de fluorescència al SAM, però al centre del SAM vam observar una disminució clara i inesperada de VENUS associada amb TagBFP. Això confirma que el patró de senyalització observat per qmRGA reflecteix la degradació dependent de GA de mRGA-VENUS, però també demostra que qmRGA pot sobreestimar l'activitat de senyalització GA al centre del meristema. En resum, els nostres resultats revelen un patró de senyalització GA que reflecteix principalment la distribució dels primordis. Aquesta distribució de la regió interprimordial (IPR) es deu a l'establiment gradual d'una alta activitat de senyalització GA entre el primordi en desenvolupament i la regió central, mentre que al mateix temps l'activitat de senyalització GA al primordi disminueix (Fig. 4c, d).
La distribució dels receptors GID1b i GID1c (vegeu més amunt) suggereix que l'expressió diferencial dels receptors GA ajuda a configurar el patró d'activitat de senyalització GA al SAM. Ens vam preguntar si l'acumulació diferencial de GA podria estar implicada. Per investigar aquesta possibilitat, vam utilitzar el sensor nlsGPS1 GA FRET21. Es va detectar una freqüència d'activació més gran al SAM de nlsGPS1 tractat amb 10 μM de GA4+7 durant 100 min (Fig. suplementària 9a-e), cosa que indica que nlsGPS1 respon als canvis en la concentració de GA al SAM, tal com ho fa a les arrels21. La distribució espacial de la freqüència d'activació de nlsGPS1 va revelar nivells de GA relativament baixos a les capes externes del SAM, però va mostrar que estaven elevats al centre i a les vores del SAM (Fig. 4e i Fig. suplementària 9a,c). Això suggereix que GA també es distribueix al SAM amb un patró espacial comparable al revelat per qmRGA. Com a enfocament complementari, també vam tractar el SAM amb GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl sol com a control negatiu. El senyal Fl es va distribuir per tot el SAM, incloent-hi la regió central i el primordi, tot i que a una intensitat més baixa (Fig. 4j i Fig. suplementària 10d). En canvi, els tres GA-Fl es van acumular específicament dins dels límits del primordi i en diversos graus a la resta de l'IPR, amb GA7-Fl acumulant-se al domini més gran de l'IPR (Fig. 4k i Fig. suplementàries 10a,b). La quantificació de la intensitat de fluorescència va revelar que la relació d'intensitat IPR a no IPR era més alta en el SAM tractat amb GA-Fl en comparació amb el SAM tractat amb Fl (Fig. 4l i Fig. suplementària 10c). Junts, aquests resultats suggereixen que el GA està present a concentracions més altes en cèl·lules IPR que es troben més a prop de la frontera de l'òrgan. Això suggereix que el patró d'activitat de senyalització GA de la SAM és el resultat tant de l'expressió diferencial dels receptors GA com de l'acumulació diferencial de GA en cèl·lules IPR prop de les vores dels òrgans. Per tant, la nostra anàlisi va revelar un patró espaciotemporal inesperat de senyalització GA, amb una activitat més baixa al centre i primordi de la SAM i una activitat més alta a l'IPR a la regió perifèrica.
Per entendre el paper de l'activitat de senyalització diferencial de GA en el SAM, vam analitzar la correlació entre l'activitat de senyalització de GA, l'expansió cel·lular i la divisió cel·lular mitjançant imatges de lapse de temps en temps real del SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Donat el paper de GA en la regulació del creixement, s'esperava una correlació positiva amb els paràmetres d'expansió cel·lular. Per tant, primer vam comparar els mapes d'activitat de senyalització de GA amb mapes de taxa de creixement de la superfície cel·lular (com a aproximació de la força de l'expansió cel·lular per a una cèl·lula determinada i per a les cèl·lules filles en la divisió) i amb mapes d'anisotropia de creixement, que mesuren la direccionalitat de l'expansió cel·lular (també utilitzat aquí per a una cèl·lula determinada i per a les cèl·lules filles en la divisió; Fig. 5a,b, vegeu Mètodes i Mètodes suplementaris). Els nostres mapes de taxa de creixement de la superfície cel·lular de SAM són consistents amb observacions prèvies38,39, amb taxes de creixement mínimes a la frontera i taxes de creixement màximes en flors en desenvolupament (Fig. 5a). L'anàlisi de components principals (PCA) va mostrar que l'activitat de senyalització de GA estava correlacionada negativament amb la intensitat de creixement de la superfície cel·lular (Figura 5c). També vam demostrar que els principals eixos de variació, incloent-hi l'entrada de senyalització GA i la intensitat de creixement, eren ortogonals a la direcció determinada per l'alta expressió de CLV3, confirmant l'exclusió de cèl·lules del centre SAM en les anàlisis restants. L'anàlisi de correlació de Spearman va confirmar els resultats de PCA (Figura 5d), indicant que els senyals GA més alts a l'IPR no van resultar en una major expansió cel·lular. Tanmateix, l'anàlisi de correlació va revelar una lleugera correlació positiva entre l'activitat de senyalització GA i l'anisotropia de creixement (Figura 5c, d), cosa que suggereix que una major senyalització GA a l'IPR influeix en la direcció del creixement cel·lular i possiblement en la posició del pla de divisió cel·lular.
a, b Mapes de calor del creixement superficial mitjà (a) i l'anisotropia de creixement (b) en SAM promediats en set plantes independents (utilitzades com a indicadors de la força i la direcció de l'expansió cel·lular, respectivament). c L'anàlisi PCA va incloure les variables següents: senyal GA, intensitat de creixement superficial, anisotropia de creixement superficial i expressió de CLV3. El component 1 de PCA es va correlacionar principalment negativament amb la intensitat de creixement superficial i es va correlacionar positivament amb el senyal GA. El component 2 de PCA es va correlacionar principalment positivament amb l'anisotropia de creixement superficial i es va correlacionar negativament amb l'expressió de CLV3. Els percentatges representen la variació explicada per cada component. d Anàlisi de correlació de Spearman entre el senyal GA, la intensitat de creixement superficial i l'anisotropia de creixement superficial a escala de teixit, excloent CZ. El número de la dreta és el valor rho de Spearman entre dues variables. Els asteriscs indiquen casos en què la correlació/correlació negativa és altament significativa. e Visualització 3D de cèl·lules Col-0 SAM L1 mitjançant microscòpia confocal. Les noves parets cel·lulars formades al SAM (però no al primordi) a les 10 h estan acolorides segons els seus valors d'angle. La barra de colors es mostra a la cantonada inferior dreta. El requadre mostra la imatge 3D corresponent a les 0 h. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. f Els diagrames de caixa mostren les taxes de divisió cel·lular en SAM IPR i no IPR Col-0 (n = 10 plantes independents). La línia central mostra la mitjana i els límits de la caixa indiquen els percentils 25 i 75. Els bigotis indiquen els valors mínims i màxims determinats amb el programari R. Els valors de P es van obtenir amb la prova t bilateral de Welch. g, h Diagrama esquemàtic que mostra (g) com mesurar l'angle de la nova paret cel·lular (magenta) respecte a la direcció radial des del centre del SAM (línia blanca de punts) (només es consideren els valors d'angle agut, és a dir, 0-90°), i (h) les direccions circumferencials/laterals i radials dins del meristema. i Histogrames de freqüència de l'orientació del pla de divisió cel·lular a través del SAM (blau fosc), IPR (blau mitjà) i no IPR (blau clar), respectivament. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov bilateral. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. j Histogrames de freqüència de l'orientació del pla de divisió cel·lular de l'IPR al voltant de P3 (verd clar), P4 (verd mitjà) i P5 (verd fosc), respectivament. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov bilateral. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars.
Per tant, a continuació, vam investigar la correlació entre la senyalització GA i l'activitat de divisió cel·lular identificant parets cel·lulars recentment formades durant l'assaig (Fig. 5e). Aquest mètode ens va permetre mesurar la freqüència i la direcció de la divisió cel·lular. Sorprenentment, vam trobar que la freqüència de divisions cel·lulars a l'IPR i la resta del SAM (no IPR, Fig. 5f) era similar, cosa que indica que les diferències en la senyalització GA entre les cèl·lules IPR i les no IPR no afecten significativament la divisió cel·lular. Això, i la correlació positiva entre la senyalització GA i l'anisotropia de creixement, ens va portar a considerar si l'activitat de senyalització GA podria influir en l'orientació del pla de divisió cel·lular. Vam mesurar l'orientació de la nova paret cel·lular com un angle agut respecte a l'eix radial que connecta el centre del meristema i el centre de la nova paret cel·lular (Fig. 5e-i) i vam observar una clara tendència de les cèl·lules a dividir-se en angles propers als 90° respecte a l'eix radial, amb les freqüències més altes observades a 70–80° (23,28%) i 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), corresponents a divisions cel·lulars en la direcció circumferencial/transversal (Fig. 5h). Per examinar la contribució de la senyalització GA a aquest comportament de divisió cel·lular, vam analitzar els paràmetres de divisió cel·lular en l'IPR i no-IPR per separat (Fig. 5i). Vam observar que la distribució de l'angle de divisió en les cèl·lules IPR diferia de la de les cèl·lules no IPR o de les cèl·lules de tot el SAM, amb les cèl·lules IPR presentant una proporció més alta de divisions cel·lulars laterals/circulars, és a dir, 70–80° i 80–90° (33,86% i 30,71%, respectivament, proporcions corresponents) (Fig. 5i). Així, les nostres observacions van revelar una associació entre una alta senyalització GA i una orientació del pla de divisió cel·lular propera a la direcció circumferencial, similar a la correlació entre l'activitat de senyalització GA i l'anisotropia de creixement (Fig. 5c, d). Per establir encara més la conservació espacial d'aquesta associació, vam mesurar l'orientació del pla de divisió en cèl·lules IPR que envolten el primordi a partir de P3, ja que l'activitat de senyalització GA més alta es va detectar en aquesta regió a partir de P4 (Fig. 4). Els angles de divisió de l'IPR al voltant de P3 i P4 no van mostrar diferències estadísticament significatives, tot i que es va observar una major freqüència de divisions cel·lulars laterals a l'IPR al voltant de P4 (Fig. 5j). Tanmateix, a les cèl·lules IPR al voltant de P5, la diferència en l'orientació del pla de divisió cel·lular es va tornar estadísticament significativa, amb un fort augment de la freqüència de divisions cel·lulars transversals (Fig. 5j). En conjunt, aquests resultats suggereixen que la senyalització GA pot controlar l'orientació de les divisions cel·lulars en el SAM, la qual cosa és coherent amb informes anteriors40,41 que una alta senyalització GA pot induir l'orientació lateral de les divisions cel·lulars a l'IPR.
Es preveu que les cèl·lules de l'IPR no s'incorporaran als primordis, sinó als internodes2,42,43. L'orientació transversal de les divisions cel·lulars a l'IPR pot donar lloc a l'organització típica de files longitudinals paral·leles de cèl·lules epidèrmiques als internodes. Les nostres observacions descrites anteriorment suggereixen que la senyalització GA probablement juga un paper en aquest procés regulant la direcció de la divisió cel·lular.
La pèrdua de funció de diversos gens DELLA resulta en una resposta GA constitutiva, i els mutants della es poden utilitzar per provar aquesta hipòtesi44. Primer vam analitzar els patrons d'expressió de cinc gens DELLA en el SAM. La fusió transcripcional de la línia GUS45 va revelar que GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (en molta menor mesura) s'expressaven en el SAM (Fig. suplementària 11a-d). La hibridació in situ va demostrar a més que l'ARNm de GAI s'acumula específicament en primordis i flors en desenvolupament (Fig. suplementària 11e). L'ARNm de RGL1 i RGL3 es va detectar a tota la capçada del SAM i en flors més velles, mentre que l'ARNm de RGL2 era més abundant a la regió fronterera (Fig. suplementària 11f-h). La imatge confocal del SAM pRGL3::RGL3-GFP va confirmar l'expressió observada per hibridació in situ i va mostrar que la proteïna RGL3 s'acumula a la part central del SAM (Fig. suplementària 11i). Utilitzant la línia pRGA::GFP-RGA, també vam trobar que la proteïna RGA s'acumula al SAM, però la seva abundància disminueix a la frontera a partir de P4 (Fig. suplementària 11j). Cal destacar que els patrons d'expressió de RGL3 i RGA són consistents amb una major activitat de senyalització GA a l'IPR, detectada per qmRGA (Fig. 4). A més, aquestes dades indiquen que tots els DELLA s'expressen al SAM i que la seva expressió abasta col·lectivament tot el SAM.
A continuació, vam analitzar els paràmetres de divisió cel·lular en el SAM de tipus salvatge (Ler, control) i els mutants gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quíntuple (global) (Fig. 6a, b). Curiosament, vam observar un canvi estadísticament significatiu en la distribució de les freqüències angulars de divisió cel·lular en el SAM mutant della global en comparació amb el tipus salvatge (Fig. 6c). Aquest canvi en el mutant della global es va deure a un augment en la freqüència d'angles de 80–90° (34,71% vs. 24,55%) i, en menor mesura, angles de 70–80° (23,78% vs. 20,18%), és a dir, corresponents a divisions cel·lulars transversals (Fig. 6c). La freqüència de divisions no transversals (0–60°) també va ser menor en el mutant della global (Fig. 6c). La freqüència de divisions cel·lulars transversals va augmentar significativament en el SAM del mutant della global (Fig. 6b). La freqüència de divisions cel·lulars transversals en l'IPR també va ser més alta en el mutant della global en comparació amb el tipus salvatge (Fig. 6d). Fora de la regió IPR, el tipus salvatge tenia una distribució més uniforme dels angles de divisió cel·lular, mentre que el mutant della global preferia les divisions tangencials com l'IPR (Fig. 6e). També vam quantificar l'orientació de les divisions cel·lulars en el SAM dels mutants quíntuples de ga2 oxidasa (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), un fons mutant inactiu de GA en què s'acumula GA. D'acord amb l'augment dels nivells de GA, el SAM de la inflorescència mutant quíntuple ga2ox era més gran que el de Col-0 (Fig. suplementària 12a, b), i en comparació amb Col-0, el SAM quíntuple ga2ox va mostrar una distribució clarament diferent dels angles de divisió cel·lular, amb la freqüència de l'angle augmentant de 50° a 90°, és a dir, afavorint de nou les divisions tangencials (Fig. suplementària 12a-c). Així, mostrem que l'activació constitutiva de la senyalització GA i l'acumulació de GA indueixen divisions cel·lulars laterals a l'IPR i a la resta del SAM.
a, b Visualització 3D de la capa L1 de SAM tenyit amb PI de Ler (a) i mutant della global (b) mitjançant microscòpia confocal. Es mostren i es coloregen les noves parets cel·lulars formades al SAM (però no al primordi) durant un període de 10 h segons els seus valors d'angle. El requadre mostra el SAM a les 0 h. La barra de colors es mostra a la cantonada inferior dreta. La fletxa de (b) apunta a un exemple de fitxers cel·lulars alineats al mutant della global. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. Comparació de la distribució de freqüències de les orientacions del pla de divisió cel·lular a tot el SAM (d), IPR (e) i no IPR (f) entre Ler i della global. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov bilateral. f, g Visualització 3D d'imatges confocals de SAM tenyit amb PI de plantes transgèniques Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Els panells (a, b) mostren noves parets cel·lulars (però no primordis) formades al SAM en 10 h. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. h–j Comparació de la distribució de freqüències de les orientacions del pla de divisió cel·lular localitzades a tot el SAM (h), IPR (i) i no IPR (j) entre les plantes Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov bilateral.
A continuació, vam provar l'efecte d'inhibir la senyalització GA específicament en l'IPR. Amb aquesta finalitat, vam utilitzar el promotor de la copa de cotiledó 2 (CUC2) per impulsar l'expressió d'una proteïna gai-1 dominant negativa fusionada a VENUS (a la línia pCUC2::gai-1-VENUS). En el SAM de tipus salvatge, el promotor CUC2 impulsa l'expressió de la majoria d'IPRs en el SAM, incloses les cèl·lules frontereres, des de P4 en endavant, i es va observar una expressió específica similar en plantes pCUC2::gai-1-VENUS (vegeu més avall). La distribució dels angles de divisió cel·lular a través del SAM o l'IPR de les plantes pCUC2::gai-1-VENUS no va ser significativament diferent de la del tipus salvatge, tot i que inesperadament vam trobar que les cèl·lules sense IPR en aquestes plantes es van dividir a una freqüència més alta de 80-90° (Fig. 6f-j).
S'ha suggerit que la direcció de la divisió cel·lular depèn de la geometria del SAM, en particular de la tensió de tracció generada per la curvatura del teixit46. Per tant, ens vam preguntar si la forma del SAM estava alterada en les plantes mutant della global i pCUC2::gai-1-VENUS. Com s'havia informat anteriorment12, la mida del SAM mutant della global era més gran que la del tipus salvatge (Fig. suplementària 13a, b, d). La hibridació in situ de CLV3 i STM RNA va confirmar l'expansió del meristema en els mutants della i va mostrar a més l'expansió lateral del nínxol de cèl·lules mare (Fig. suplementària 13e, f, h, i). Tanmateix, la curvatura del SAM va ser similar en ambdós genotips (Fig. suplementària 13k, m, n, p). Vam observar un augment similar de mida en el mutant quàdruple della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 sense un canvi de curvatura en comparació amb el tipus salvatge (Fig. suplementària 13c, d, g, j, l, o, p). La freqüència d'orientació de la divisió cel·lular també es va veure afectada en el mutant quàdruple della, però en menor mesura que en el mutant monolític della (Fig. suplementària 12d-f). Aquest efecte de dosificació, juntament amb la manca d'un efecte sobre la curvatura, suggereix que l'activitat residual de RGL3 en el mutant quàdruple Della limita els canvis en l'orientació de la divisió cel·lular causats per la pèrdua de l'activitat DELLA i que els canvis en les divisions cel·lulars laterals es produeixen en resposta a canvis en l'activitat de senyalització GA en lloc de canvis en la geometria del SAM. Com s'ha descrit anteriorment, el promotor CUC2 impulsa l'expressió d'IPR al SAM a partir de P4 (Fig. suplementària 14a, b), i en canvi, el SAM pCUC2::gai-1-VENUS tenia una mida reduïda però una curvatura més alta (Fig. suplementària 14c-h). Aquest canvi en la morfologia del SAM pCUC2::gai-1-VENUS pot resultar en una distribució diferent de les tensions mecàniques en comparació amb el tipus salvatge, en què les tensions circumferencials elevades comencen a una distància més curta del centre del SAM47. Alternativament, els canvis en la morfologia de pCUC2::gai-1-VENUS SAM poden ser el resultat de canvis en les propietats mecàniques regionals induïts per l'expressió transgènica48. En ambdós casos, això podria compensar parcialment els efectes dels canvis en la senyalització GA augmentant la probabilitat que les cèl·lules es divideixin en l'orientació circumferencial/transversal, cosa que explica les nostres observacions.
En conjunt, les nostres dades confirmen que la senyalització GA més alta juga un paper actiu en l'orientació lateral del pla de divisió cel·lular a l'IPR. També mostren que la curvatura del meristema també influeix en l'orientació del pla de divisió cel·lular a l'IPR.
L'orientació transversal del pla de divisió a l'IPR, a causa de l'alta activitat de senyalització GA, suggereix que GA preorganitza un fitxer cel·lular radial a l'epidermis dins del SAM per definir l'organització cel·lular que posteriorment es trobarà a l'internod epidèrmic. De fet, aquests fitxers cel·lulars eren freqüentment visibles a les imatges SAM de mutants della globals (Fig. 6b). Per tant, per explorar més a fons la funció de desenvolupament del patró espacial de la senyalització GA al SAM, vam utilitzar imatges de lapse de temps per analitzar l'organització espacial de les cèl·lules a l'IPR en plantes de tipus salvatge (Ler i Col-0), mutants della globals i plantes transgèniques pCUC2::gai-1-VENUS.
Vam trobar que qmRGA mostrava que l'activitat de senyalització GA a l'IPR augmentava des de P1/P2 i arribava al màxim a P4, i aquest patró es mantenia constant al llarg del temps (Fig. 4a-f i Fig. suplementària 8c-f, k). Per analitzar l'organització espacial de les cèl·lules a l'IPR amb l'augment del senyal GA, vam etiquetar les cèl·lules IPR de Ler per sobre i als costats de P4 segons el seu destí de desenvolupament analitzat 34 h després de la primera observació, és a dir, més de dues vegades al plastidi, cosa que ens permetia seguir les cèl·lules IPR durant el desenvolupament del primordi des de P1/P2 fins a P4. Vam utilitzar tres colors diferents: groc per a les cèl·lules que es van integrar al primordi prop de P4, verd per a les que estaven a l'IPR i morat per a les que van participar en ambdós processos (Fig. 7a-c). A t0 (0 h), es veien 1-2 capes de cèl·lules IPR davant de P4 (Fig. 7a). Com s'esperava, quan aquestes cèl·lules es dividien, ho feien principalment a través del pla de divisió transversal (Figs. 7a-c). Es van obtenir resultats similars utilitzant Col-0 SAM (centrant-se en P3, la vora del qual es plega de manera similar a P4 en Ler), tot i que en aquest genotip el plec format a la vora floral va amagar les cèl·lules IPR més ràpidament (Fig. 7g-i). Així, el patró de divisió de les cèl·lules IPR preorganitza les cèl·lules en files radials, com en els internodes. L'organització de les files radials i la localització de les cèl·lules IPR entre òrgans successius suggereixen que aquestes cèl·lules són progenitores internodals.
Aquí, hem desenvolupat un biosensor de senyalització GA ratiomètrica, qmRGA, que permet el mapatge quantitatiu de l'activitat de senyalització GA resultant de concentracions combinades de GA i receptors GA alhora que minimitza la interferència amb les vies de senyalització endògenes, proporcionant així informació sobre la funció GA a nivell cel·lular. Amb aquesta finalitat, hem construït una proteïna DELLA modificada, mRGA, que ha perdut la capacitat d'unir-se a parelles d'interacció DELLA però que continua sent sensible a la proteòlisi induïda per GA. qmRGA respon tant als canvis exògens com endògens en els nivells de GA, i les seves propietats de detecció dinàmica permeten avaluar els canvis espaciotemporals en l'activitat de senyalització GA durant el desenvolupament. qmRGA també és una eina molt flexible, ja que es pot adaptar a diferents teixits canviant el promotor utilitzat per a la seva expressió (si cal), i donada la naturalesa conservada de la via de senyalització GA i el motiu PFYRE a través de les angiospermes, és probable que sigui transferible a altres espècies22. D'acord amb això, també es va demostrar que una mutació equivalent a la proteïna DELLA de l'arròs SLR1 (HYY497AAA) suprimia l'activitat repressora del creixement de SLR1 mentre que només reduïa lleugerament la seva degradació mediada per GA, de manera similar a mRGA23. Cal destacar que estudis recents en Arabidopsis van mostrar que una mutació d'un sol aminoàcid al domini PFYRE (S474L) alterava l'activitat transcripcional de RGA sense afectar la seva capacitat d'interactuar amb els factors de transcripció associats50. Tot i que aquesta mutació és molt propera a les 3 substitucions d'aminoàcids presents a mRGA, els nostres estudis mostren que aquestes dues mutacions alteren característiques diferents de DELLA. Tot i que la majoria dels factors de transcripció associats s'uneixen als dominis LHR1 i SAW de DELLA26,51, alguns aminoàcids conservats al domini PFYRE poden ajudar a estabilitzar aquestes interaccions.
El desenvolupament internodal és un tret clau en l'arquitectura vegetal i la millora del rendiment. qmRGA va revelar una major activitat de senyalització GA en les cèl·lules progenitores internodals de l'IPR. Combinant imatges quantitatives i genètica, vam demostrar que els patrons de senyalització GA superposen plans de divisió cel·lular circulars/transversals a l'epidermis SAM, donant forma a l'organització de la divisió cel·lular necessària per al desenvolupament internodal. S'han identificat diversos reguladors de l'orientació del pla de divisió cel·lular durant el desenvolupament52,53. El nostre treball proporciona un exemple clar de com l'activitat de senyalització GA regula aquest paràmetre cel·lular. DELLA pot interactuar amb complexos proteics de preplegament41, de manera que la senyalització GA pot regular l'orientació del pla de divisió cel·lular influint directament en l'orientació dels microtúbuls corticals40,41,54,55. Inesperadament, vam demostrar que en SAM, el correlat d'una major activitat de senyalització GA no era l'elongació o la divisió cel·lular, sinó només l'anisotropia del creixement, cosa que és coherent amb un efecte directe de GA sobre la direcció de la divisió cel·lular a l'IPR. Tanmateix, no podem excloure que aquest efecte també pugui ser indirecte, per exemple mediat per l'estovament de la paret cel·lular induït per GA56. Els canvis en les propietats de la paret cel·lular indueixen estrès mecànic57,58, que també pot influir en l'orientació del pla de divisió cel·lular afectant l'orientació dels microtúbuls corticals39,46,59. Els efectes combinats de l'estrès mecànic induït per GA i la regulació directa de l'orientació dels microtúbuls per GA poden estar implicats en la generació d'un patró específic d'orientació de la divisió cel·lular a l'IPR per definir els internodes, i calen més estudis per provar aquesta idea. De la mateixa manera, estudis previs han destacat la importància de les proteïnes TCP14 i 15 que interactuen amb DELLA en el control de la formació d'internodes60,61 i aquests factors poden mediar l'acció de GA juntament amb BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), que regulen el desenvolupament dels internodes i s'ha demostrat que influeixen en la senyalització de GA2,62. Atès que els DELLA interactuen amb les vies de senyalització de brassinoesteroides, etilè, àcid jasmònic i àcid abscísic (ABA)63,64 i que aquestes hormones poden influir en l'orientació dels microtúbuls65, els efectes de l'AG en l'orientació de la divisió cel·lular també poden estar mediats per altres hormones.
Els primers estudis citològics van mostrar que tant les regions internes com les externes de la SAM d'Arabidopsis són necessàries per al desenvolupament dels internodes2,42. El fet que el GA reguli activament la divisió cel·lular en els teixits interns12 dóna suport a una doble funció del GA en la regulació de la mida del meristem i l'internod en la SAM. El patró de divisió cel·lular direccional també està estretament regulat en el teixit SAM intern, i aquesta regulació és essencial per al creixement de la tija52. Serà interessant examinar si el GA també juga un paper en l'orientació del pla de divisió cel·lular en l'organització de la SAM interna, sincronitzant així l'especificació i el desenvolupament dels internodes dins de la SAM.
Les plantes es van cultivar in vitro en sòl o en un medi 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) suplementat amb 1% de sacarosa i 1% d'agar (Sigma) en condicions estàndard (16 h de llum, 22 °C), excepte per als experiments de creixement d'hipocòtils i arrels en què les plàntules es van cultivar en plaques verticals sota llum constant i 22 °C. Per als experiments amb nitrat, les plantes es van cultivar en un medi MS modificat (medi per a plantes bioWORLD) suplementat amb nitrat adequat (0 o 10 mM de KNO3), 0,5 mM de succinat de NH4, 1% de sacarosa i 1% d'agar-A (Sigma) en condicions de dia llarg.
El cDNA de GID1a inserit a pDONR221 es va recombinar amb pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry a pB7m34GW per generar pUBQ10::GID1a-mCherry. El cDNA d'IDD2 inserit a pDONR221 es va recombinar en pB7RWG266 per generar p35S:IDD2-RFP. Per generar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, primer es van amplificar un fragment de 3,9 kb aigües amunt de la regió codificant de GID1b i un fragment de 4,7 kb que contenia el cDNA de GID1b (1,3 kb) i el terminador (3,4 kb) utilitzant els encebadors de la Taula Suplementària 3 i després es van inserir a pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivament, i finalment es van recombinar amb pDONR221 2xmTQ268 al vector diana pGreen 012567 mitjançant la clonació Gateway. Per generar pCUC2::LSSmOrange, la seqüència promotora de CUC2 (3229 pb aigües amunt d'ATG) seguida de la seqüència codificant de mOrange amb desplaçament de Stokes gran (LSSmOrange)69 amb el senyal de localització nuclear N7 i el terminador transcripcional NOS es van assemblar al vector de direccionament de kanamicina pGreen utilitzant el sistema de recombinació de 3 fragments Gateway (Invitrogen). El vector binari vegetal es va introduir a la soca GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens i es va introduir a les fulles de Nicotiana benthamiana mitjançant el mètode d'infiltració d'Agrobacterium i a Arabidopsis thaliana Col-0 mitjançant el mètode de immersió floral, respectivament. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA es van aïllar de les descendències F3 i F1 dels encreuaments respectius, respectivament.
La hibridació in situ d'ARN es va realitzar en puntes de brots d'aproximadament 1 cm de llarg72, que es van recollir i fixar immediatament en una solució de FAA (3,7% de formaldehid, 5% d'àcid acètic, 50% d'etanol) prèviament refredada a 4 °C. Després de 2 tractaments al buit de 15 min, es va canviar el fixador i les mostres es van incubar durant la nit. Els cDNA de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 i les sondes antisentit per als seus 3'-UTR es van sintetitzar utilitzant els encebadors que es mostren a la Taula Suplementària 3, tal com descriuen Rosier et al.73. Les sondes marcades amb digoxigenina es van immunodetectar mitjançant anticossos de digoxigenina (dilució de 3000 vegades; Roche, número de catàleg: 11 093 274 910), i les seccions es van tenyir amb una solució de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat (BCIP, dilució de 250 vegades)/tetrazoli de nitroblau (NBT, dilució de 200 vegades).
Data de publicació: 10 de febrer de 2025