El creixement del meristem apical (SAM) és fonamental per a l'arquitectura de la tija. Hormones vegetalsgiberel·lines(GAs) juguen un paper clau en la coordinació del creixement de les plantes, però el seu paper en el SAM continua sent poc conegut. Aquí, hem desenvolupat un biosensor ratiomètric de senyalització GA mitjançant l'enginyeria de la proteïna DELLA per suprimir la seva funció reguladora essencial en la resposta transcripcional de GA tot preservant la seva degradació després del reconeixement de GA. Demostrem que aquest biosensor basat en la degradació registra amb precisió els canvis en els nivells de GA i la detecció cel·lular durant el desenvolupament. Hem utilitzat aquest biosensor per mapar l'activitat de senyalització GA al SAM. Mostrem que els senyals elevats de GA estan presents predominantment a les cèl·lules situades entre els primordis dels òrgans, que són precursors de les cèl·lules entrenudes. Utilitzant enfocaments de guany i pèrdua de funció, demostrem a més que GA regula l'orientació del pla de divisió cel·lular, establint l'organització cel·lular canònica dels entrenudes, promovent així l'especificació d'entrenudes al SAM.
El meristema apical del brot (SAM), situat a l'àpex del brot, conté un nínxol de cèl·lules mare l'activitat de les quals genera òrgans laterals i nodes mare de manera modular i iterativa al llarg de la vida de la planta. Cadascuna d'aquestes unitats repetitives, o nodes vegetals, inclou entrenusos i òrgans laterals als nusos, i meristemes axil·lars a les axil·les de les fulles1. El creixement i l'organització dels nodes de les plantes canvia durant el desenvolupament. A Arabidopsis, el creixement internodal es suprimeix durant l'etapa vegetativa i els meristemes axil·lars romanen latents a les axelles de les fulles de roseta. Durant la transició a la fase floral, el SAM es converteix en el meristema de la inflorescència, generant entrenusos allargats i brots axil·lars, branques a l'axil·la de les fulles caulinades i, posteriorment, flors sense fulles2. Tot i que hem avançat significativament en la comprensió dels mecanismes que controlen l'inici de fulles, flors i branques, se sap relativament poc sobre com sorgeixen els entrenusos.
Entendre la distribució espaciotemporal dels GA ajudarà a entendre millor les funcions d'aquestes hormones en diferents teixits i en diferents etapes de desenvolupament. La visualització de la degradació de la fusió RGA-GFP expressada sota l'acció del seu propi promotor proporciona informació important sobre la regulació dels nivells totals de GA a les arrels15,16. Tanmateix, l'expressió RGA varia entre els teixits17 i està regulada per GA18. Així, l'expressió diferencial del promotor RGA pot donar lloc al patró de fluorescència observat amb RGA-GFP i, per tant, aquest mètode no és quantitatiu. Més recentment, GA19,20 marcat amb fluoresceïna bioactiva (Fl) va revelar l'acumulació de GA a l'endocòrtex de l'arrel i la regulació dels seus nivells cel·lulars mitjançant el transport de GA. Recentment, el sensor GA FRET nlsGPS1 va demostrar que els nivells de GA es correlacionen amb l'allargament cel·lular a les arrels, filaments i hipocòtils de creixement fosc21. Tanmateix, com hem vist, la concentració de GA no és l'únic paràmetre que controla l'activitat de senyalització de GA, ja que depèn de processos de detecció complexos. Aquí, basant-nos en la nostra comprensió de les vies de senyalització DELLA i GA, informem del desenvolupament i caracterització d'un biosensor ratiomètric basat en la degradació per a la senyalització de GA. Per desenvolupar aquest biosensor quantitatiu, vam utilitzar un RGA mutant sensible a GA que es va fusionar amb una proteïna fluorescent i expressat de manera ubiqua als teixits, així com una proteïna fluorescent insensible a GA. Mostrem que les fusions de proteïnes RGA mutants no interfereixen amb la senyalització GA endògena quan s'expressen de manera ubiqua, i que aquest biosensor pot quantificar l'activitat de senyalització resultant tant de l'entrada de GA com del processament del senyal GA per part de l'aparell de detecció amb una alta resolució espaciotemporal. Hem utilitzat aquest biosensor per mapejar la distribució espaciotemporal de l'activitat de senyalització de GA i quantificar com GA regula el comportament cel·lular a l'epidermis SAM. Demostrem que GA regula l'orientació del pla de divisió de les cèl·lules SAM situades entre els primordis dels òrgans, definint així l'organització cel·lular canònica de l'entrenus.
Finalment, vam preguntar si qmRGA podria informar canvis en els nivells de GA endògens mitjançant hipocòtils en creixement. Abans vam demostrar que el nitrat estimula el creixement augmentant la síntesi de GA i, al seu torn, la degradació de DELLA34. En conseqüència, vam observar que la longitud de l'hipocòtil a les plàntules pUBQ10::qmRGA cultivades amb abundant subministrament de nitrats (10 mM NO3-) era significativament més llarga que la de les plàntules cultivades en condicions de deficiència de nitrats (figura suplementària 6a). D'acord amb la resposta de creixement, els senyals de GA eren més alts en els hipocòtils de les plàntules cultivades en condicions de 10 mM NO3- que en les plàntules cultivades en absència de nitrat (figura suplementària 6b, c). Així, qmRGA també permet el seguiment dels canvis en la senyalització de GA induïts per canvis endògens en la concentració de GA.
Per entendre si l'activitat de senyalització de GA detectada per qmRGA depèn de la concentració de GA i la percepció de GA, com s'esperava en funció del disseny del sensor, es va analitzar l'expressió dels tres receptors GID1 en teixits vegetatius i reproductius. A les plàntules, la línia de reporter GID1-GUS va mostrar que GID1a i c estaven molt expressats en cotiledons (Fig. 3a-c). A més, els tres receptors es van expressar en fulles, primordis de les arrels laterals, puntes de les arrels (excepte la tapa de l'arrel de GID1b) i el sistema vascular (Fig. 3a-c). A la inflorescència SAM, vam detectar senyals GUS només per a GID1b i 1c (figura suplementària 7a-c). La hibridació in situ va confirmar aquests patrons d'expressió i va demostrar a més que GID1c s'expressava de manera uniforme a nivells baixos al SAM, mentre que GID1b va mostrar una expressió més alta a la perifèria del SAM (figura suplementària 7d-l). La fusió translacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b també va revelar un rang gradual d'expressió de GID1b, des d'una expressió baixa o nul·la al centre de la SAM fins a una expressió alta a les vores de l'òrgan (figura suplementària 7m). Així, els receptors GID1 no es distribueixen uniformement entre i dins dels teixits. En experiments posteriors, també vam observar que la sobreexpressió de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) augmentava la sensibilitat de qmRGA en hipocòtils a l'aplicació externa de GA (Fig. 3d, e). En canvi, la fluorescència mesurada per qd17mRGA a l'hipocòtil era insensible al tractament amb GA3 (Fig. 3f, g). Per a ambdós assaigs, les plàntules es van tractar amb altes concentracions de GA (100 μM GA3) per avaluar el comportament ràpid del sensor, on es va millorar o es va perdre la capacitat d'unir-se al receptor GID1. En conjunt, aquests resultats confirmen que el biosensor qmRGA té una funció combinada com a sensor GA i GA i suggereixen que l'expressió diferencial del receptor GID1 pot modular significativament l'emissivitat del sensor.
Fins ara, la distribució dels senyals GA al SAM encara no està clara. Per tant, hem utilitzat plantes que expressen qmRGA i el reporter de cèl·lules mare pCLV3::mCherry-NLS35 per calcular mapes quantitatius d'alta resolució de l'activitat de senyalització GA, centrant-nos en la capa L1 (epidermis; Fig. 4a, b, vegeu Mètodes i mètodes suplementaris), ja que L1 juga un paper clau en el control del creixement SAM36. Aquí, l'expressió pCLV3::mCherry-NLS va proporcionar un punt de referència geomètric fix per analitzar la distribució espaciotemporal de l'activitat de senyalització GA37. Tot i que la GA es considera essencial per al desenvolupament dels òrgans laterals4, vam observar que els senyals de GA eren baixos al primordi floral (P) a partir de l'etapa P3 (Fig. 4a, b), mentre que els primordis joves P1 i P2 tenien una activitat moderada similar a la de la regió central (Fig. 4a, b). Es va detectar una activitat de senyalització GA més alta als límits del primordi de l'òrgan, començant a P1 / P2 (als costats del límit) i assolint un pic a P4, així com a totes les cèl·lules de la regió perifèrica situada entre els primordi (Fig. 4a, b i Fig. 8a, b suplementària). Aquesta activitat de senyalització GA més alta es va observar no només a l'epidermis, sinó també a les capes L2 i L3 superior (figura suplementària 8b). El patró de senyals GA detectats al SAM mitjançant qmRGA també es va mantenir sense canvis al llarg del temps (figura suplementària 8c–f, k). Tot i que la construcció qd17mRGA es va regular sistemàticament a la SAM de les plantes T3 a partir de cinc línies independents que vam caracteritzar amb detall, vam poder analitzar els patrons de fluorescència obtinguts amb la construcció pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (figura suplementària 8g–j, l). En aquesta línia de control, només es van detectar canvis menors en la relació de fluorescència al SAM, però al centre SAM vam observar una disminució clara i inesperada de VENUS associada a TagBFP. Això confirma que el patró de senyalització observat per qmRGA reflecteix la degradació de mRGA-VENUS depenent de GA, però també demostra que qmRGA pot sobreestimar l'activitat de senyalització de GA al centre del meristema. En resum, els nostres resultats revelen un patró de senyalització GA que reflecteix principalment la distribució dels primordis. Aquesta distribució de la regió interprimordial (IPR) es deu a l'establiment gradual d'una alta activitat de senyalització GA entre el primordi en desenvolupament i la regió central, mentre que, al mateix temps, l'activitat de senyalització GA al primordi disminueix (Fig. 4c, d).
La distribució dels receptors GID1b i GID1c (vegeu més amunt) suggereix que l'expressió diferencial dels receptors GA ajuda a donar forma al patró de l'activitat de senyalització GA al SAM. Ens vam preguntar si podria estar implicada l'acumulació diferencial de GA. Per investigar aquesta possibilitat, hem utilitzat el sensor nlsGPS1 GA FRET21. Es va detectar un augment de la freqüència d'activació en el SAM de nlsGPS1 tractat amb 10 μM GA4 + 7 durant 100 min (figura suplementària 9a-e), cosa que indica que nlsGPS1 respon als canvis en la concentració de GA al SAM, com ho fa a les arrels21. La distribució espacial de la freqüència d'activació de nlsGPS1 va revelar nivells de GA relativament baixos a les capes exteriors del SAM, però va demostrar que estaven elevats al centre i als límits del SAM (Fig. 4e i Fig. 9a, c suplementària). Això suggereix que GA també es distribueix al SAM amb un patró espacial comparable al revelat per qmRGA. Com a enfocament complementari, també vam tractar el SAM amb GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl sol com a control negatiu. El senyal Fl es va distribuir per tot el SAM, incloent la regió central i el primordi, encara que a una intensitat més baixa (Fig. 4j i Fig. 10d suplementària). En canvi, els tres GA-Fl es van acumular específicament dins de les fronteres del primordi i en diferents graus a la resta de l'IPR, amb GA7-Fl acumulant-se al domini més gran de l'IPR (Fig. 4k i Fig. 10a, b suplementària). La quantificació de la intensitat de fluorescència va revelar que la relació d'intensitat IPR i no IPR era més alta en el SAM tractat amb GA-Fl en comparació amb el SAM tractat amb Fl (figura 4l i figura suplementària 10c). En conjunt, aquests resultats suggereixen que GA està present a concentracions més altes a les cèl·lules IPR que es troben més a prop de la vora de l'òrgan. Això suggereix que el patró de l'activitat de senyalització SAM GA resulta tant de l'expressió diferencial dels receptors de GA com de l'acumulació diferencial de GA a les cèl·lules IPR prop de les fronteres dels òrgans. Així, la nostra anàlisi va revelar un patró espaciotemporal inesperat de senyalització GA, amb menor activitat al centre i primordi de la SAM i una activitat més alta en l'IPR a la regió perifèrica.
Per entendre el paper de l'activitat de senyalització GA diferencial al SAM, es va analitzar la correlació entre l'activitat de senyalització GA, l'expansió cel·lular i la divisió cel·lular mitjançant imatges en temps real del SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Tenint en compte el paper de GA en la regulació del creixement, s'esperava una correlació positiva amb els paràmetres d'expansió cel·lular. Per tant, primer vam comparar els mapes d'activitat de senyalització de GA amb mapes de la taxa de creixement de la superfície cel·lular (com a indicador de la força de l'expansió cel·lular per a una cèl·lula determinada i per a cèl·lules filles a la divisió) i amb mapes d'anisotropia de creixement, que mesura la direccionalitat de l'expansió cel·lular (també s'utilitza aquí per a una cèl·lula determinada i per a cèl·lules filles a la divisió; Fig. 5a, b, vegeu Mètodes i suplements). Els nostres mapes de la taxa de creixement de la superfície cel·lular SAM són coherents amb les observacions anteriors38,39, amb taxes de creixement mínimes a la frontera i taxes de creixement màximes en les flors en desenvolupament (Fig. 5a). L'anàlisi de components principals (PCA) va mostrar que l'activitat de senyalització GA estava correlacionada negativament amb la intensitat de creixement de la superfície cel·lular (figura 5c). També vam demostrar que els eixos principals de variació, inclosa l'entrada de senyalització GA i la intensitat de creixement, eren ortogonals a la direcció determinada per l'expressió CLV3 alta, confirmant l'exclusió de cèl·lules del centre SAM a les anàlisis restants. L'anàlisi de correlació de Spearman va confirmar els resultats de la PCA (figura 5d), cosa que indica que els senyals de GA més alts a l'IPR no van donar lloc a una expansió cel·lular més gran. Tanmateix, l'anàlisi de correlació va revelar una lleugera correlació positiva entre l'activitat de senyalització de GA i l'anisotropia del creixement (figura 5c, d), cosa que suggereix que una senyalització de GA més alta a l'IPR influeix en la direcció del creixement cel·lular i possiblement en la posició del pla de divisió cel·lular.
a, b Els mapes de calor del creixement mitjà de la superfície (a) i de l'anisotropia del creixement (b) en SAM van tenir una mitjana de set plantes independents (utilitzades com a indicadors per a la força i la direcció de l'expansió cel·lular, respectivament). c L'anàlisi de PCA va incloure les variables següents: senyal GA, intensitat de creixement superficial, anisotropia de creixement superficial i expressió de CLV3. El component 1 de PCA es va correlacionar principalment negativament amb la intensitat del creixement superficial i positivament amb el senyal GA. El component 2 de PCA es va correlacionar principalment positivament amb l'anisotropia del creixement superficial i negativament amb l'expressió CLV3. Els percentatges representen la variació explicada per cada component. d Anàlisi de la correlació de Spearman entre el senyal GA, la intensitat del creixement superficial i l'anisotropia del creixement superficial a escala de teixits excloent CZ. El nombre de la dreta és el valor rho de Spearman entre dues variables. Els asteriscs indiquen casos en què la correlació/correlació negativa és altament significativa. e Visualització 3D de cèl·lules Col-0 SAM L1 mitjançant microscòpia confocal. Les noves parets cel·lulars formades al SAM (però no al primordi) a les 10 h es coloren segons els seus valors d'angle. La barra de colors es mostra a la cantonada inferior dreta. El requadre mostra la imatge 3D corresponent a les 0 h. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. f Els diagrames de caixa mostren taxes de divisió cel·lular en IPR i no IPR Col-0 SAM (n = 10 plantes independents). La línia central mostra la mediana i els límits del quadre indiquen els percentils 25 i 75. Els bigotis indiquen els valors mínims i màxims determinats amb el programari R. Els valors de P es van obtenir amb la prova t de dues cues de Welch. g, h Diagrama esquemàtic que mostra (g) com mesurar l'angle de la nova paret cel·lular (magenta) respecte a la direcció radial des del centre de la SAM (línia de punts blancs) (només es consideren valors d'angle agut, és a dir, 0-90 °), i (h) les direccions circumferencial/lateral i radial dins del meristema. i Histogrames de freqüència de l'orientació del pla de divisió cel·lular a través del SAM (blau fosc), IPR (blau mitjà) i no IPR (blau clar), respectivament. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov de dues cues. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. j Histogrames de freqüència de l'orientació del pla de divisió cel·lular de l'IPR al voltant de P3 (verd clar), P4 (verd mitjà) i P5 (verd fosc), respectivament. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov de dues cues. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars.
Per tant, a continuació es va investigar la correlació entre la senyalització GA i l'activitat de la divisió cel·lular mitjançant la identificació de parets cel·lulars de nova formació durant l'assaig (Fig. 5e). Aquest enfocament ens va permetre mesurar la freqüència i la direcció de la divisió cel·lular. Sorprenentment, vam trobar que la freqüència de divisions cel·lulars a l'IPR i a la resta de la SAM (no IPR, Fig. 5f) era similar, cosa que indica que les diferències en la senyalització GA entre les cèl·lules IPR i les no IPR no afecten significativament la divisió cel·lular. Això, i la correlació positiva entre la senyalització de GA i l'anisotropia del creixement, ens van impulsar a considerar si l'activitat de senyalització de GA podria influir en l'orientació del pla de divisió cel·lular. Vam mesurar l'orientació de la nova paret cel·lular com un angle agut respecte a l'eix radial que connecta el centre del meristema i el centre de la nova paret cel·lular (Fig. 5e-i) i vam observar una clara tendència de les cèl·lules a dividir-se en angles propers a 90 ° respecte a l'eix radial, amb les freqüències més altes observades a 70–80. (Fig. 5e,i), corresponent a les divisions cel·lulars en sentit circumferencial/transversal (Fig. 5h). Per examinar la contribució de la senyalització GA a aquest comportament de la divisió cel·lular, hem analitzat els paràmetres de divisió cel·lular a l'IPR i no a l'IPR per separat (Fig. 5i). Vam observar que la distribució de l'angle de divisió a les cèl·lules IPR era diferent de la de les cèl·lules no IPR o a les cèl·lules de tot el SAM, amb les cèl·lules IPR que presentaven una proporció més alta de divisions cel·lulars laterals / circulars, és a dir, 70-80 ° i 80-90 ° (33, 86% i 30, 71%, respectivament, proporcions corresponents). (Fig. 5i). Així, les nostres observacions van revelar una associació entre una senyalització de GA alta i una orientació del pla de divisió cel·lular propera a la direcció circumferencial, similar a la correlació entre l'activitat de senyalització de GA i l'anisotropia del creixement (Fig. 5c, d). Per establir encara més la conservació espacial d'aquesta associació, es va mesurar l'orientació del pla de divisió a les cèl·lules IPR que envolten el primordi a partir de P3, ja que es va detectar la major activitat de senyalització GA en aquesta regió a partir de P4 (Fig. 4). Els angles de divisió de l'IPR al voltant de P3 i P4 no van mostrar diferències estadísticament significatives, tot i que es va observar un augment de la freqüència de divisions cel·lulars laterals a l'IPR al voltant de P4 (Fig. 5j). Tanmateix, a les cèl·lules IPR al voltant de P5, la diferència en l'orientació del pla de divisió cel·lular es va fer estadísticament significativa, amb un fort augment de la freqüència de les divisions cel·lulars transversals (Fig. 5j). En conjunt, aquests resultats suggereixen que la senyalització GA pot controlar l'orientació de les divisions cel·lulars a la SAM, cosa que és coherent amb els informes anteriors40,41 que la senyalització GA elevada pot induir l'orientació lateral de les divisions cel·lulars a la IPR.
Es preveu que les cèl·lules de l'IPR no s'incorporaran als primordis sinó als entrenudes2,42,43. L'orientació transversal de les divisions cel·lulars a l'IPR pot donar lloc a l'organització típica de files longitudinals paral·leles de cèl·lules epidèrmiques als entrenusos. Les nostres observacions descrites anteriorment suggereixen que la senyalització GA probablement juga un paper en aquest procés regulant la direcció de la divisió cel·lular.
La pèrdua de funció de diversos gens DELLA dóna lloc a una resposta constitutiva de GA i es poden utilitzar mutants della per provar aquesta hipòtesi44. Primer vam analitzar els patrons d'expressió de cinc gens DELLA al SAM. La fusió transcripcional de la línia GUS45 va revelar que GAI, RGA, RGL1 i RGL2 (en molt menor mesura) es van expressar al SAM (figura suplementària 11a-d). La hibridació in situ va demostrar a més que l'ARNm GAI s'acumula específicament als primordis i a les flors en desenvolupament (figura suplementària 11e). L'ARNm RGL1 i RGL3 es van detectar a tot el dosser SAM i a les flors més velles, mentre que l'ARNm RGL2 era més abundant a la regió fronterera (figura suplementària 11f-h). La imatge confocal de pRGL3::RGL3-GFP SAM va confirmar l'expressió observada per hibridació in situ i va demostrar que la proteïna RGL3 s'acumula a la part central de la SAM (figura suplementària 11i). Utilitzant la línia pRGA::GFP-RGA, també vam trobar que la proteïna RGA s'acumula a la SAM, però la seva abundància disminueix a la frontera a partir de P4 (figura suplementària 11j). En particular, els patrons d'expressió de RGL3 i RGA són coherents amb una major activitat de senyalització de GA a l'IPR, tal com detecta qmRGA (Fig. 4). A més, aquestes dades indiquen que tots els DELLA s'expressen al SAM i que la seva expressió abasta col·lectivament tot el SAM.
A continuació, vam analitzar els paràmetres de divisió cel·lular en el SAM de tipus salvatge (Ler, control) i els mutants gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 del quintuple (global) (Fig. 6a, b). Curiosament, vam observar un canvi estadísticament significatiu en la distribució de les freqüències de l'angle de divisió cel·lular al SAM mutant global en comparació amb el tipus salvatge (Fig. 6c). Aquest canvi en el mutant della global es va deure a un augment de la freqüència d'angles de 80-90° (34,71% vs. 24,55%) i, en menor mesura, angles de 70-80° (23,78% vs. 20,18%), és a dir, corresponents a divisions cel·lulars transversals (Fig. 6c). La freqüència de divisions no transversals (0-60 °) també va ser menor en el mutant global della (Fig. 6c). La freqüència de les divisions cel·lulars transversals va augmentar significativament a la SAM del mutant global della (Fig. 6b). La freqüència de divisions cel·lulars transversals a l'IPR també va ser més alta en el mutant global della en comparació amb el tipus salvatge (Fig. 6d). Fora de la regió IPR, el tipus salvatge tenia una distribució més uniforme dels angles de divisió cel·lular, mentre que el mutant global della preferia divisions tangencials com la IPR (Fig. 6e). També es va quantificar l'orientació de les divisions cel·lulars a la SAM de mutants quintuples de ga2 oxidasa (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 i ga2ox6-2), un fons mutant inactiu amb GA en el qual s'acumula GA. D'acord amb l'augment dels nivells de GA, la SAM de la inflorescència mutant ga2ox quíntuple era més gran que la de Col-0 (figura suplementària 12a, b) i, en comparació amb Col-0, la SAM de ga2ox quíntuple va mostrar una distribució clarament diferent dels angles de divisió cel·lular, amb la freqüència de l'angle augmentant de 50 ° a la divisió tangential de 50 ° a una altra vegada afavorint la divisió tangential 90 ° Fig. 12a–c). Així, mostrem que l'activació constitutiva de la senyalització de GA i l'acumulació de GA indueixen divisions cel·lulars laterals a l'IPR i la resta de la SAM.
a, b Visualització en 3D de la capa L1 de Ler tenyit de PI (a) i del mutant global (b) SAM mitjançant microscòpia confocal. Les noves parets cel·lulars formades al SAM (però no al primordi) durant un període de 10 hores es mostren i es coloren segons els seus valors d'angle. El requadre mostra el SAM a les 0 h. La barra de colors es mostra a l'extrem inferior dret. La fletxa de (b) assenyala un exemple de fitxers de cel·les alineats al mutant global della. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. comparació de la distribució de freqüències de les orientacions del pla de divisió cel·lular a tot el SAM (d), IPR (e) i no IPR (f) entre Ler i global della. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov de dues cues. f, g Visualització en 3D d'imatges confocals de plantes transgèniques SAM tenyides de PI de Col-0 (i) i pCUC2::gai-1-VENUS (j). Els panells (a, b) mostren noves parets cel·lulars (però no primordis) formades al SAM en 10 h. L'experiment es va repetir dues vegades amb resultats similars. h–j Comparació de la distribució de freqüències de les orientacions del plànol de divisió cel·lular situades a tot el SAM (h), IPR (i) i no IPR (j) entre plantes Col-0 i pCUC2::gai-1-VENUS. Els valors de P es van obtenir mitjançant una prova de Kolmogorov-Smirnov de dues cues.
A continuació, vam provar l'efecte d'inhibir la senyalització GA específicament a l'IPR. Amb aquesta finalitat, hem utilitzat el promotor de la copa de cotiledó 2 (CUC2) per impulsar l'expressió d'una proteïna gai-1 negativa dominant fusionada a VENUS (a la línia pCUC2::gai-1-VENUS). En el SAM de tipus salvatge, el promotor CUC2 impulsa l'expressió de la majoria de IPR al SAM, incloses les cèl·lules frontereres, a partir de P4, i es va observar una expressió específica similar a les plantes pCUC2::gai-1-VENUS (vegeu a continuació). La distribució dels angles de divisió cel·lular a través del SAM o IPR de les plantes pCUC2::gai-1-VENUS no era significativament diferent de la del tipus salvatge, tot i que de manera inesperada vam trobar que les cèl·lules sense IPR en aquestes plantes es dividien a una freqüència més alta de 80-90 ° (Fig. 6f-j).
S'ha suggerit que la direcció de la divisió cel·lular depèn de la geometria del SAM, en particular de l'esforç de tracció generat per la curvatura del teixit46. Per tant, vam preguntar si la forma del SAM es va alterar a les plantes del mutant global i pCUC2::gai-1-VENUS. Com es va informar anteriorment12, la mida del SAM mutant global era més gran que la del tipus salvatge (figura suplementària 13a, b, d). La hibridació in situ de l'ARN CLV3 i STM va confirmar l'expansió del meristema en della mutants i va mostrar, a més, l'expansió lateral del nínxol de cèl·lules mare (figura suplementària 13e, f, h, i). Tanmateix, la curvatura SAM era similar en ambdós genotips (figura suplementària 13k, m, n, p). Vam observar un augment similar de mida en el gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quàdruple mutant sense un canvi de curvatura en comparació amb el tipus salvatge (figura suplementària 13c, d, g, j, l, o, p). La freqüència de l'orientació de la divisió cel·lular també es va veure afectada en el mutant quàdruple della, però en menor mesura que en el mutant monolític della (figura suplementària 12d-f). Aquest efecte de dosificació, juntament amb la manca d'efecte sobre la curvatura, suggereix que l'activitat residual de RGL3 al mutant quadruple Della limita els canvis en l'orientació de la divisió cel·lular causats per la pèrdua de l'activitat de DELLA i que els canvis en les divisions cel·lulars laterals es produeixen en resposta als canvis en l'activitat de senyalització GA en lloc dels canvis en la geometria SAM. Com s'ha descrit anteriorment, el promotor CUC2 impulsa l'expressió IPR al SAM a partir de P4 (figura suplementària 14a, b) i, en canvi, el pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM tenia una mida reduïda però una curvatura més alta (figura suplementària 14c-h). Aquest canvi en la morfologia pCUC2::gai-1-VENUS SAM pot donar lloc a una distribució diferent de les tensions mecàniques en comparació amb el tipus salvatge, en què les tensions circumferencials altes comencen a una distància més curta del centre SAM47. Alternativament, els canvis en la morfologia de pCUC2::gai-1-VENUS SAM poden resultar de canvis en les propietats mecàniques regionals induïdes per l'expressió transgènica48. En ambdós casos, això podria compensar parcialment els efectes dels canvis en la senyalització GA augmentant la probabilitat que les cèl·lules es divideixin en l'orientació circumferencial / transversal, explicant les nostres observacions.
En conjunt, les nostres dades confirmen que la senyalització GA més alta té un paper actiu en l'orientació lateral del pla de divisió cel·lular a l'IPR. També mostren que la curvatura del meristema també influeix en l'orientació del pla de divisió cel·lular a l'IPR.
L'orientació transversal del pla de divisió a l'IPR, a causa de l'alta activitat de senyalització de GA, suggereix que GA preorganitza un fitxer cel·lular radial a l'epidermis dins del SAM per definir l'organització cel·lular que es trobarà posteriorment a l'entrenus epidèrmic. De fet, aquests fitxers cel·lulars eren freqüentment visibles a les imatges SAM de mutants globals (Fig. 6b). Així, per explorar encara més la funció de desenvolupament del patró espacial de la senyalització de GA al SAM, vam utilitzar imatges de lapse de temps per analitzar l'organització espacial de les cèl·lules a l'IPR en plantes transgèniques de tipus salvatge (Ler i Col-0), della global mutants i pCUC2::gai-1-VENUS.
Vam trobar que qmRGA va mostrar que l'activitat de senyalització de GA a l'IPR va augmentar des de P1 / P2 i va assolir el màxim a P4, i aquest patró es va mantenir constant al llarg del temps (Fig. 4a–f i Fig. 8c–f suplementària, k). Per analitzar l'organització espacial de les cèl·lules a l'IPR amb un senyal GA creixent, vam etiquetar les cèl·lules IPR de Ler a sobre i als costats de P4 segons el seu destí de desenvolupament analitzat 34 h després de la primera observació, és a dir, més de dos temps plastids, cosa que ens va permetre seguir les cèl·lules IPR durant el desenvolupament del primordi de P1/P2 a P4. Hem utilitzat tres colors diferents: groc per a aquelles cèl·lules que estaven integrades al primordi prop de P4, verd per a les que estaven a l'IPR i morat per a les que van participar en ambdós processos (Fig. 7a-c). A t0 (0 h), 1-2 capes de cèl·lules IPR eren visibles davant de P4 (Fig. 7a). Com era d'esperar, quan aquestes cèl·lules es van dividir, ho van fer principalment mitjançant el pla de divisió transversal (Figs. 7a–c). Es van obtenir resultats similars mitjançant Col-0 SAM (centrant-se en P3, la vora del qual es plega de manera similar a P4 a Ler), tot i que en aquest genotip el plec format a la vora floral amagava les cèl·lules IPR més ràpidament (Fig. 7g–i). Així, el patró de divisió de les cèl·lules IPR preorganitza les cèl·lules en files radials, com en els entrenusos. L'organització de les files radials i la localització de cèl·lules IPR entre òrgans successius suggereixen que aquestes cèl·lules són progenitores internodals.
Aquí, hem desenvolupat un biosensor de senyalització GA ratiomètric, qmRGA, que permet un mapeig quantitatiu de l'activitat de senyalització GA resultant de concentracions combinades de receptors GA i GA alhora que minimitza la interferència amb les vies de senyalització endògenes, proporcionant així informació sobre la funció de GA a nivell cel·lular. Amb aquesta finalitat, vam construir una proteïna DELLA modificada, mRGA, que ha perdut la capacitat d'unir els socis d'interacció DELLA, però segueix sent sensible a la proteòlisi induïda per GA. qmRGA respon als canvis tant exògens com endògens en els nivells de GA, i les seves propietats de detecció dinàmica permeten avaluar els canvis espaciotemporals en l'activitat de senyalització de GA durant el desenvolupament. qmRGA també és una eina molt flexible, ja que es pot adaptar a diferents teixits canviant el promotor utilitzat per a la seva expressió (si cal) i donada la naturalesa conservada de la via de senyalització GA i el motiu PFYRE a través de les angiospermes, és probable que sigui transferible a altres espècies22. D'acord amb això, també es va demostrar que una mutació equivalent a la proteïna DELLA d'arròs SLR1 (HYY497AAA) suprimeix l'activitat repressor del creixement de SLR1 mentre que només redueix lleugerament la seva degradació mediada per GA, similar a mRGA23. En particular, estudis recents a Arabidopsis van demostrar que una única mutació d'aminoàcids al domini PFYRE (S474L) va alterar l'activitat transcripcional de RGA sense afectar la seva capacitat d'interaccionar amb els socis del factor de transcripció50. Tot i que aquesta mutació és molt propera a les substitucions de 3 aminoàcids presents a mRGA, els nostres estudis mostren que aquestes dues mutacions alteren característiques diferents de DELLA. Tot i que la majoria dels socis del factor de transcripció s'uneixen als dominis LHR1 i SAW de DELLA26,51, alguns aminoàcids conservats al domini PFYRE poden ajudar a estabilitzar aquestes interaccions.
El desenvolupament internodal és un tret clau en l'arquitectura vegetal i la millora del rendiment. qmRGA va revelar una major activitat de senyalització GA en les cèl·lules progenitores internodals de l'IPR. Combinant imatges quantitatives i genètica, vam demostrar que els patrons de senyalització GA superposen plans de divisió cel·lular circulars/transversals a l'epidermis SAM, donant forma a l'organització de la divisió cel·lular necessària per al desenvolupament internodal. S'han identificat diversos reguladors de l'orientació del pla de divisió cel·lular durant el desenvolupament52,53. El nostre treball proporciona un exemple clar de com l'activitat de senyalització GA regula aquest paràmetre cel·lular. DELLA pot interactuar amb complexos proteics de preplegament41, de manera que la senyalització GA pot regular l'orientació del pla de divisió cel·lular influint directament en l'orientació dels microtúbuls corticals40,41,54,55. Inesperadament, vam demostrar que en SAM, el correlat d'una major activitat de senyalització GA no era l'elongació o la divisió cel·lular, sinó només l'anisotropia del creixement, cosa que és coherent amb un efecte directe de GA sobre la direcció de la divisió cel·lular a l'IPR. Tanmateix, no podem excloure que aquest efecte també pugui ser indirecte, per exemple mediat per l'estovament de la paret cel·lular induït per GA56. Els canvis en les propietats de la paret cel·lular indueixen estrès mecànic57,58, que també pot influir en l'orientació del pla de divisió cel·lular afectant l'orientació dels microtúbuls corticals39,46,59. Els efectes combinats de l'estrès mecànic induït per GA i la regulació directa de l'orientació dels microtúbuls per GA poden estar implicats en la generació d'un patró específic d'orientació de la divisió cel·lular a l'IPR per definir els internodes, i calen més estudis per provar aquesta idea. De la mateixa manera, estudis previs han destacat la importància de les proteïnes TCP14 i 15 que interactuen amb DELLA en el control de la formació d'internodes60,61 i aquests factors poden mediar l'acció de GA juntament amb BREVIPEDICELLUS (BP) i PENNYWISE (PNY), que regulen el desenvolupament dels internodes i s'ha demostrat que influeixen en la senyalització de GA2,62. Atès que els DELLA interactuen amb les vies de senyalització de brassinoesteroides, etilè, àcid jasmònic i àcid abscísic (ABA)63,64 i que aquestes hormones poden influir en l'orientació dels microtúbuls65, els efectes de l'AG en l'orientació de la divisió cel·lular també poden estar mediats per altres hormones.
Els primers estudis citològics van demostrar que les regions interiors i exteriors de l'Arabidopsis SAM són necessàries per al desenvolupament dels entrenus2,42. El fet que GA reguli activament la divisió cel·lular als teixits interns12 admet una doble funció de GA en la regulació de la mida del meristema i dels entrenus a la SAM. El patró de divisió cel·lular direccional també està estretament regulat al teixit SAM intern, i aquesta regulació és essencial per al creixement de la tija52. Serà interessant examinar si GA també té un paper en l'orientació del pla de divisió cel·lular en l'organització interna del SAM, sincronitzant així l'especificació i el desenvolupament dels entrenusos dins del SAM.
Les plantes es van cultivar in vitro a terra o 1x medi Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) complementat amb 1% de sacarosa i 1% d'agar (Sigma) en condicions estàndard (16 h de llum, 22 ° C), excepte per als experiments de creixement d'hipocòtils i arrels en què les plàntules es van cultivar en plaques verticals amb llum constant i 22 ° C. Per a experiments amb nitrats, les plantes es van cultivar en medi MS modificat (medi vegetal bioWORLD) complementat amb nitrat adequat (0 o 10 mM KNO3), succinat NH4 0,5 mM, sacarosa 1% i agar A 1% (Sigma) en condicions de llarg dia.
L'ADNc de GID1a inserit a pDONR221 es va recombinar amb pDONR P4-P1R-pUBQ10 i pDONR P2R-P3-mCherry a pB7m34GW per generar pUBQ10::GID1a-mCherry. L'ADN IDD2 inserit a pDONR221 es va recombinar a pB7RWG266 per generar p35S:IDD2-RFP. Per generar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, primer es va amplificar un fragment de 3,9 kb aigües amunt de la regió de codificació GID1b i un fragment de 4,7 kb que contenia l'ADNc GID1b (1,3 kb) i el terminador (3,4 kb) utilitzant els cebadors de la taula suplementària P1R i després PR4 inserit a la taula suplementària P1R Scientific) i pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivament, i finalment recombinat amb pDONR221 2xmTQ268 al vector objectiu pGreen 012567 mitjançant la clonació de Gateway. Per generar pCUC2::LSSmOrange, la seqüència del promotor CUC2 (3229 pb aigües amunt de l'ATG) seguida de la seqüència de codificació de gran mOrange desplaçat per Stokes (LSSmOrange)69 amb el senyal de localització nuclear N7 i el terminador transcripcional NOS es van reunir al vector pGreen emprant el sistema de recombinació de kanamicina objectiu Gateway3. (Invitrogen). El vector binari de la planta es va introduir a la soca GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens i es va introduir a les fulles de Nicotiana benthamiana mitjançant el mètode d'infiltració d'Agrobacterium i a Arabidopsis thaliana Col-0 mitjançant el mètode d'immersió floral, respectivament. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry i pCLV3::mCherry-NLS qmRGA es van aïllar de les descendències F3 i F1 de les respectives creus, respectivament.
La hibridació in situ d'ARN es va realitzar en puntes de brots d'aproximadament 1 cm de llarg72, que es van recollir i es van fixar immediatament en una solució FAA (3, 7% de formaldehid, 5% d'àcid acètic, 50% d'etanol) prerefridada a 4 ° C. Després de tractaments al buit de 2 × 15 min, es va canviar el fixador i les mostres es van incubar durant la nit. Els cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 i RGL3 i les sondes antisentit als seus 3′-UTR es van sintetitzar mitjançant els primers que es mostren a la Taula Suplementària 3 tal com descriuen Rosier et al.73. Les sondes marcades amb digoxigenina es van immunodetectar mitjançant anticossos de digoxigenina (dilució de 3.000 vegades; Roche, número de catàleg: 11 093 274 910) i les seccions es van tenyir amb fosfat de 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP, 250 vegades de tetrazol·lil) dilució de 200 vegades).
Hora de publicació: 10-feb-2025