Les proteïnes DELLA es conservenreguladors de creixementque tenen un paper central en el desenvolupament de les plantes en resposta a senyals interns i externs. Com a reguladors transcripcionals, els DELLA s'uneixen als factors de transcripció (TF) i a la histona H2A a través dels seus dominis GRAS i són reclutats per actuar sobre els promotors. Estudis recents han demostrat que l'estabilitat dels DELLA està regulada posttraduccionalment per dos mecanismes: la poliubiquitinació induïda per l'hormona vegetalgiberel·lina, cosa que condueix a la seva ràpida degradació i a la conjugació amb un petit modificador semblant a la ubiquitina (SUMO), que augmenta la seva acumulació. A més, l'activitat de DELLA està regulada dinàmicament per dos mecanismes de glicosilació diferents: l'O-fucosilació millora la interacció DELLA-TF, mentre que la modificació de N-acetilglucosamina lligada a O (O-GlcNAc) inhibeix la interacció DELLA-TF. Tanmateix, el paper de la fosforilació de DELLA no està clar, ja que estudis anteriors han mostrat resultats contradictoris, alguns suggereixen que la fosforilació promou o reprimeix la degradació de DELLA i altres que la fosforilació no afecta la seva estabilitat. Aquí, identifiquem llocs de fosforilació al repressor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificat d'Arabidopsis thaliana per espectrometria de masses i mostrem que la fosforilació de dos pèptids RGA a les regions PolyS i PolyS/T millora l'activitat RGA promovent la unió a H2A i l'associació RGA amb els promotors diana. Cal destacar que la fosforilació no va afectar les interaccions RGA-TF ni l'estabilitat de RGA. El nostre estudi revela un mecanisme molecular pel qual la fosforilació indueix l'activitat DELLA.
La nostra anàlisi espectrometrica de masses va revelar que tant Pep1 com Pep2 estaven altament fosforilats en RGA en el fons Ga1 deficient en GA. A més d'aquest estudi, estudis fosfoproteòmics també han revelat la fosforilació de Pep1 en RGA, tot i que el seu paper encara no s'ha estudiat53,54,55. En canvi, la fosforilació de Pep2 no s'ha descrit prèviament, ja que aquest pèptid només es podia detectar mitjançant el transgèn RGAGKG. Tot i que la mutació m1A, que va abolir la fosforilació de Pep1, només va reduir lleugerament l'activitat de RGA a la planta, va tenir un efecte additiu quan es va combinar amb m2A en la reducció de l'activitat de RGA (Figura suplementària 6). És important destacar que la fosforilació de Pep1 es va reduir significativament en el mutant sly1 potenciat per GA en comparació amb ga1, cosa que suggereix que GA promou la desfosforilació de RGA, reduint la seva activitat. El mecanisme pel qual GA suprimeix la fosforilació de RGA requereix més investigació. Una possibilitat és que això s'aconsegueixi mitjançant la regulació d'una proteïna cinasa no identificada. Tot i que els estudis han demostrat que l'expressió de la proteïna cinasa CK1 EL1 està regulada a la baixa per GA en l'arròs41, els nostres resultats indiquen que les mutacions d'ordre superior de l'homòleg EL1 d'Arabidopsis (AEL1-4) no redueixen la fosforilació de RGA. D'acord amb els nostres resultats, un estudi fosfoproteòmic recent utilitzant línies que sobreexpressen AEL d'Arabidopsis i un triple mutant ael no va identificar cap proteïna DELLA com a substrats d'aquestes cinases56. Quan vam preparar el manuscrit, es va informar que GSK3, el gen que codifica una cinasa similar a GSK3/SHAGGY en el blat (Triticum aestivum), pot fosforilar DELLA (Rht-B1b)57, tot i que la fosforilació de Rht-B1b per GSK3 no s'ha confirmat in planta. Les reaccions enzimàtiques in vitro en presència de GSK3 seguides d'una anàlisi d'espectrometria de masses van revelar tres llocs de fosforilació situats entre els dominis DELLA i GRAS de Rht-B1b (Figura suplementària 3). Les substitucions de serina per alanina en els tres llocs de fosforilació van provocar una disminució de l'activitat de Rht-B1b en el blat transgènic, cosa que concorda amb les nostres troballes que les substitucions d'alanina en Pep2 RGA van disminuir l'activitat de RGA. Tanmateix, els assaigs de degradació de proteïnes in vitro van demostrar encara més que la fosforilació també pot estabilitzar Rht-B1b57. Això contrasta amb els nostres resultats que mostren que les substitucions d'alanina en Pep2 RGA no alteren la seva estabilitat in planta. GSK3 en el blat és un ortòleg de la proteïna 2 insensible als brassinoesteroides (BIN2) en Arabidopsis 57. BIN2 és un regulador negatiu de la senyalització BR, i BR activa la seva via de senyalització causant la degradació de BIN2 58. Vam demostrar que el tractament amb BR no redueix l'estabilitat de RGA 59 ni els nivells de fosforilació en Arabidopsis (Figura suplementària 2), cosa que suggereix que és poc probable que RGA sigui fosforilada per BIN2.
Totes les dades quantitatives es van analitzar estadísticament mitjançant Excel i les diferències significatives es van determinar mitjançant la prova t de Student. No es van utilitzar mètodes estadístics per predeterminar la mida de la mostra. No es van excloure dades de l'anàlisi; l'experiment no va ser aleatoritzat; i els investigadors eren conscients de l'assignació durant l'experiment i l'avaluació dels resultats. Les mides de la mostra es proporcionen a les llegendes de les figures i als fitxers de dades en brut.
Data de publicació: 15 d'abril de 2025