Les proteïnes DELLA es conservenreguladors del creixementque tenen un paper central en el desenvolupament de les plantes en resposta a senyals interns i externs. Com a reguladors transcripcionals, els DELLA s'uneixen als factors de transcripció (TF) i a la histona H2A a través dels seus dominis GRAS i són reclutats per actuar sobre els promotors. Estudis recents han demostrat que l'estabilitat dels DELLA està regulada posttraduccionalment per dos mecanismes: la poliubiquitinació induïda per l'hormona vegetalgiberel·lina, que condueix a la seva ràpida degradació, i la conjugació amb un petit modificador semblant a la ubiquitina (SUMO), que augmenta la seva acumulació. A més, l'activitat de DELLA està regulada dinàmicament per dos mecanismes de glicosilació diferents: la O-fucosilació millora la interacció DELLA-TF, mentre que la modificació de N-acetilglucosamina (O-GlcNAc) lligada a O inhibeix la interacció DELLA-TF. Tanmateix, el paper de la fosforilació DELLA no està clar, ja que estudis anteriors han mostrat resultats contradictoris, alguns suggereixen que la fosforilació promou o reprimeix la degradació de DELLA i altres suggereixen que la fosforilació no afecta la seva estabilitat. Aquí, identifiquem llocs de fosforilació al repressor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificat d'Arabidopsis thaliana per espectrometria de masses i mostrem que la fosforilació de dos pèptids RGA a les regions PolyS i PolyS/T millora l'activitat RGA promovent la unió a H2A i l'associació RGA amb promotors diana. En particular, la fosforilació no va afectar les interaccions RGA-TF ni l'estabilitat RGA. El nostre estudi revela un mecanisme molecular pel qual la fosforilació indueix l'activitat DELLA.
La nostra anàlisi espectromètrica de masses va revelar que tant Pep1 com Pep2 estaven molt fosforilats en RGA en el fons de Ga1 amb deficiència de GA. A més d'aquest estudi, els estudis fosfoproteòmics també han revelat la fosforilació de Pep1 en RGA, tot i que encara no s'ha estudiat el seu paper53,54,55. En canvi, la fosforilació de Pep2 no s'ha descrit prèviament, ja que aquest pèptid només es va poder detectar mitjançant el transgen RGAGKG. Tot i que la mutació m1A, que va abolir la fosforilació de Pep1, només va reduir lleugerament l'activitat RGA a la planta, va tenir un efecte additiu quan es va combinar amb m2A per reduir l'activitat RGA (figura suplementària 6). És important destacar que la fosforilació de Pep1 es va reduir significativament en el mutant sly1 millorat amb GA en comparació amb ga1, cosa que suggereix que GA promou la desfosforilació RGA, reduint la seva activitat. El mecanisme pel qual GA suprimeix la fosforilació de RGA requereix una investigació addicional. Una possibilitat és que això s'aconsegueixi mitjançant la regulació d'una proteïna quinasa no identificada. Tot i que els estudis han demostrat que l'expressió de la proteïna quinasa CK1 EL1 està regulada a la baixa per GA a l'arròs41, els nostres resultats indiquen que les mutacions d'ordre superior de l'homòleg d'Arabidopsis EL1 (AEL1-4) no redueixen la fosforilació RGA. D'acord amb els nostres resultats, un estudi fosfoproteòmic recent utilitzant línies de sobreexpressió AEL d'Arabidopsis i un mutant triple ael no va identificar cap proteïna DELLA com a substrat d'aquestes cinases56. Quan vam preparar el manuscrit, es va informar que GSK3, el gen que codifica una quinasa semblant a GSK3/SHAGGY en el blat (Triticum aestivum), pot fosforilar DELLA (Rht-B1b)57, tot i que la fosforilació de Rht-B1b per GSK3 no s'ha confirmat a planta. Les reaccions enzimàtiques in vitro en presència de GSK3 seguides de l'anàlisi d'espectrometria de masses van revelar tres llocs de fosforilació situats entre els dominis DELLA i GRAS de Rht-B1b (figura suplementària 3). Les substitucions de serina a alanina als tres llocs de fosforilació van donar lloc a una disminució de l'activitat Rht-B1b en el blat transgènic, d'acord amb les nostres troballes que les substitucions d'alanina a Pep2 RGA van disminuir l'activitat RGA. Tanmateix, els assajos de degradació de proteïnes in vitro van demostrar encara més que la fosforilació també pot estabilitzar Rht-B1b57. Això contrasta amb els nostres resultats que mostren que les substitucions d'alanina a Pep2 RGA no alteren la seva estabilitat a la planta. GSK3 al blat és un ortòleg de la proteïna 2 insensible als brassinosteroides (BIN2) a Arabidopsis 57. BIN2 és un regulador negatiu de la senyalització BR, i BR activa la seva via de senyalització provocant la degradació de BIN2 58. Hem demostrat que el tractament amb BR no redueix l'estabilitat de RGA 59 o la fosforilació 59, cosa que suggereix que els nivells d'Arabipsidació (RGA2) suggereixen és poc probable que sigui fosforilada per BIN2.
Totes les dades quantitatives es van analitzar estadísticament mitjançant Excel i es van determinar diferències significatives mitjançant la prova t de Student. No es van utilitzar mètodes estadístics per predeterminar la mida de la mostra. No es van excloure dades de l'anàlisi; l'experiment no va ser aleatoritzat; i els investigadors eren conscients de l'assignació durant l'experiment i l'avaluació dels resultats. Les mides de mostra es proporcionen a les llegendes de les figures i als fitxers de dades en brut.
Hora de publicació: 15-abril-2025