La fosforilació activa el regulador principal del creixement DELLA a Arabidopsis promovent l'associació de la histona H2A amb la cromatina.

Les proteïnes DELLA es conserven mestresreguladors del creixementque tenen un paper central en el control del desenvolupament de les plantes en resposta a senyals interns i ambientals. DELLA actua com a regulador transcripcional i es recluta per orientar els promotors unint-se als factors de transcripció (TF) i la histona H2A a través del seu domini GRAS. Estudis recents han demostrat que l'estabilitat de DELLA està regulada post-traduccionalment mitjançant dos mecanismes: la poliubiquitinació induïda per la fitohormona giberel·lina, que condueix a la seva ràpida degradació, i la conjugació de petits modificadors semblants a la ubiquitina (SUMO) per augmentar la seva acumulació. A més, l'activitat DELLA està regulada dinàmicament per dues glicosilacions diferents: la interacció DELLA-TF es veu millorada per la O-fucosilació però s'inhibeix per la modificació de la N-acetilglucosamina (O-GlcNAc) lligada a O. No obstant això, el paper de la fosforilació DELLA no està clar, ja que estudis anteriors han mostrat resultats contradictoris, que van des dels que mostren que la fosforilació promou o redueix la degradació de DELLA fins a altres que mostren que la fosforilació no afecta la seva estabilitat. Aquí, identifiquem els llocs de fosforilació a REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) purificat d'Arabidopsis thaliana mitjançant anàlisi d'espectrometria de masses i mostren que la fosforilació de dos pèptids RGA a les regions PolyS i PolyS/T afavoreix la unió a H2A i l'activitat RGA millorada. Associació de RGA amb promotors objectiu. En particular, la fosforilació no afecta les interaccions RGA-TF ni l'estabilitat RGA. El nostre estudi revela el mecanisme molecular pel qual la fosforilació indueix l'activitat DELLA.
Per dilucidar el paper de la fosforilació en la regulació de la funció DELLA, és fonamental identificar els llocs de fosforilació DELLA in vivo i realitzar anàlisis funcionals a les plantes. Mitjançant la purificació per afinitat d'extractes de plantes seguida d'una anàlisi MS/MS, vam identificar diversos fosfosits en RGA. En condicions de deficiència de GA, la fosforilació de RHA augmenta, però la fosforilació no afecta la seva estabilitat. És important destacar que els assajos co-IP i ChIP-qPCR van revelar que la fosforilació a la regió PolyS/T de RGA promou la seva interacció amb H2A i la seva associació amb promotors diana, revelant el mecanisme pel qual la fosforilació indueix la funció RGA.
RGA es recluta per orientar la cromatina mitjançant la interacció del subdomini LHR1 amb TF i després s'uneix a H2A a través de la seva regió PolyS/T i el subdomini PFYRE, formant el complex H2A-RGA-TF per estabilitzar RGA. La fosforilació de Pep 2 a la regió PolyS/T entre el domini DELLA i el domini GRAS per una cinasa no identificada millora la unió RGA-H2A. La proteïna mutant rgam2A suprimeix la fosforilació RGA i adopta una conformació proteica diferent per interferir amb la unió de H2A. Això resulta en la desestabilització de les interaccions transitòries TF-rgam2A i la dissociació de rgam2A de la cromatina objectiu. Aquesta figura només representa la repressió transcripcional mediada per RGA. Es podria descriure un patró similar per a l'activació transcripcional mediada per RGA, excepte que el complex H2A-RGA-TF promouria la transcripció del gen objectiu i la desfosforilació de rgam2A disminuiria la transcripció. Figura modificada de Huang et al.21.
Totes les dades quantitatives es van analitzar estadísticament mitjançant Excel i es van determinar diferències significatives mitjançant la prova t de Student. No es van utilitzar mètodes estadístics per determinar preliminarment la mida de la mostra. No es van excloure dades de l'anàlisi; l'experiment no va ser aleatoritzat; els investigadors no estaven cecs a la distribució de dades durant l'experiment i l'avaluació dels resultats. La mida de la mostra s'indica a la llegenda de la figura i al fitxer de dades font.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'informe Natural Portfolio associat a aquest article.
Les dades de proteòmica d'espectrometria de masses s'han aportat al consorci ProteomeXchange a través del dipòsit de socis PRIDE66 amb l'identificador de conjunt de dades PXD046004. La resta de dades obtingudes durant aquest estudi es presenten als fitxers d'informació suplementària, fitxers de dades suplementàries i fitxers de dades en brut. Les dades font d'aquest article es proporcionen.