Aquest estudi va avaluar la letalitat, la subletalitat i la toxicitat dels comercialscipermetrinaformulacions per a capgrossos anurs. A la prova aguda, es van provar concentracions de 100-800 μg/L durant 96 h. A la prova crònica, es van provar les concentracions de cipermetrina naturals (1, 3, 6 i 20 μg/L) per determinar la mortalitat, seguida de proves de micronuclis i anomalies nuclears de glòbuls vermells durant 7 dies. La LC50 de la formulació comercial de cipermetrina als capgrossos va ser de 273, 41 μg L−1. A la prova crònica, la concentració més alta (20 μg L−1) va provocar una mortalitat superior al 50%, ja que va matar la meitat dels capgrossos provats. La prova del micronucli va mostrar resultats significatius a 6 i 20 μg L−1 i es van detectar diverses anomalies nuclears, cosa que indica que la formulació comercial de cipermetrina té potencial genotòxic contra P. gracilis. La cipermetrina és un risc elevat per a aquesta espècie, el que indica que pot causar múltiples problemes i afectar la dinàmica d'aquest ecosistema a curt i llarg termini. Per tant, es pot concloure que les formulacions comercials de cipermetrina tenen efectes tòxics sobre P. gracilis.
A causa de l'expansió contínua de les activitats agrícoles i l'aplicació intensiva decontrol de plaguesmesures, els animals aquàtics estan freqüentment exposats a pesticides1,2. La contaminació dels recursos hídrics a prop dels camps agrícoles pot afectar el desenvolupament i la supervivència d'organismes no objectiu com els amfibis.
Els amfibis són cada cop més importants en l'avaluació de les matrius ambientals. Els anurans es consideren bons bioindicadors de contaminants ambientals a causa de les seves característiques úniques, com ara cicles vitals complexos, ritmes ràpids de creixement larvari, estat tròfic, pell permeable10,11, dependència de l'aigua per a la reproducció12 i ous sense protecció11,13,14. S'ha demostrat que la granota d'aigua (Physalaemus gracilis), comunament coneguda com la granota ploradora, és una espècie bioindicadora de la contaminació per pesticides4,5,6,7,15. L'espècie es troba en aigües estancades, àrees protegides o zones amb hàbitat variable a Argentina, Uruguai, Paraguai i Brasil1617 i es considera estable per la classificació de la UICN per la seva àmplia distribució i tolerància als diferents hàbitats18.
S'han reportat efectes subletals en amfibis després de l'exposició a la cipermetrina, incloent canvis de comportament, morfològics i bioquímics en capgròs23,24,25, alteració del temps de mortalitat i metamorfosi, canvis enzimàtics, disminució de l'èxit de l'eclosió24,25, hiperactivitat26, inhibició de l'activitat de la colinesterasa27 i canvis en el rendiment de la natació27,28. Tanmateix, els estudis sobre els efectes genotòxics de la cipermetrina en amfibis són limitats. Per tant, és important avaluar la susceptibilitat de les espècies d'anurs a la cipermetrina.
La contaminació ambiental afecta el creixement i desenvolupament normals dels amfibis, però l'efecte advers més greu és el dany genètic a l'ADN causat per l'exposició a pesticides13. L'anàlisi de la morfologia de les cèl·lules sanguínies és un bioindicador important de la contaminació i la toxicitat potencial d'una substància per a les espècies silvestres29. La prova del micronucli és un dels mètodes més utilitzats per determinar la genotoxicitat de substàncies químiques en el medi ambient30. És un mètode ràpid, eficaç i econòmic que és un bon indicador de la contaminació química d'organismes com els amfibis31,32 i que pot proporcionar informació sobre l'exposició a contaminants genotòxics33.
L'objectiu d'aquest estudi era avaluar el potencial tòxic de les formulacions comercials de cipermetrina per a petits capgrossos aquàtics mitjançant una prova de micronuclis i una avaluació del risc ecològic.
Mortalitat acumulada (%) de capgrossos de P. gracilis exposats a diferents concentracions de cipermetrina comercial durant el període agut de la prova.
Mortalitat acumulada (%) de capgrossos de P. gracilis exposats a diferents concentracions de cipermetrina comercial durant una prova crònica.
L'elevada mortalitat observada va ser el resultat dels efectes genotòxics en amfibis exposats a diferents concentracions de cipermetrina (6 i 20 μg/L), com ho demostra la presència de micronuclis (MN) i anomalies nuclears en els eritròcits. La formació de MN indica errors en la mitosi i s'associa amb una mala unió dels cromosomes als microtúbuls, defectes en complexos proteics responsables de la captació i transport dels cromosomes, errors en la segregació cromosòmica i errors en la reparació del dany en l'ADN38,39 i pot estar relacionat amb l'estrès oxidatiu induït per pesticides40,41. Es van observar altres anomalies a totes les concentracions avaluades. L'augment de les concentracions de cipermetrina va augmentar les anomalies nuclears dels eritròcits en un 5% i un 20% a les dosis més baixes (1 μg/L) i més altes (20 μg/L), respectivament. Per exemple, els canvis en l'ADN d'una espècie poden tenir conseqüències greus tant per a la supervivència a curt com a llarg termini, donant lloc a una disminució de la població, alteració de l'aptitud reproductiva, consanguinitat, pèrdua de diversitat genètica i taxes de migració alterades. Tots aquests factors poden afectar la supervivència i el manteniment de les espècies42,43. La formació d'anomalies eritroides pot indicar un bloqueig en la citocinesi, que resulta en una divisió cel·lular anormal (eritròcits binucleats)44,45; els nuclis multilobulats són protuberàncies de la membrana nuclear amb múltiples lòbuls46, mentre que altres anomalies eritroides poden estar associades a l'amplificació de l'ADN, com ara els ronyons/ampolles nuclears47. La presència d'eritròcits anucleats pot indicar un deteriorament del transport d'oxigen, especialment en aigües contaminades48,49. L'apoptosi indica mort cel·lular50.
Altres estudis també han demostrat els efectes genotòxics de la cipermetrina. Kabaña et al.51 van demostrar la presència de micronuclis i canvis nuclears com ara cèl·lules binucleades i cèl·lules apoptòtiques a les cèl·lules d'Odontophrynus americanus després d'exposició a altes concentracions de cipermetrina (5000 i 10.000 μg L−1) durant 96 h. També es va detectar apoptosi induïda per cipermetrina a P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Aquests resultats suggereixen que la cipermetrina té efectes genotòxics en una sèrie d'organismes aquàtics i que l'assaig MN i ENA pot ser un indicador d'efectes subletals sobre els amfibis i pot ser aplicable a espècies natives i poblacions salvatges exposades a tòxics12.
Les formulacions comercials de cipermetrina suposen un alt perill ambiental (tant agut com crònic), amb uns seus que superen el nivell de l'Agència de Protecció del Medi Ambient (EPA) dels EUA54 que poden afectar negativament l'espècie si està present al medi ambient. En l'avaluació del risc crònic, el NOEC de mortalitat va ser de 3 μg L−1, confirmant que les concentracions trobades a l'aigua poden suposar un risc per a l'espècie55. El NOEC letal per a les larves de R. arenarum exposades a una barreja d'endosulfan i cipermetrina va ser de 500 μg L−1 després de 168 h; aquest valor va disminuir a 0,0005 μg L−1 després de 336 h. Els autors demostren que com més llarga sigui l'exposició, menors seran les concentracions perjudicials per a l'espècie. També és important destacar que els valors de NOEC eren més alts que els de P. gracilis en el mateix temps d'exposició, cosa que indica que la resposta de l'espècie a la cipermetrina és específica de l'espècie. A més, pel que fa a la mortalitat, el valor de CHQ de P. gracilis després de l'exposició a la cipermetrina va arribar a 64,67, que és superior al valor de referència establert per l'Agència de Protecció del Medi Ambient dels EUA54, i el valor de CHQ de les larves de R. arenarum també va ser superior a aquest valor (CHQ > 388,00 després de 336 h), cosa que indica que els insecticides estudiats representen un alt risc per als insecticides estudiats. espècies. Tenint en compte que P. gracilis requereix aproximadament 30 dies per completar la metamorfosi56, es pot concloure que les concentracions estudiades de cipermetrina poden contribuir a la disminució de la població evitant que els individus infectats entrin a l'etapa adulta o reproductiva a una edat primerenca.
En l'avaluació del risc calculat dels micronuclis i altres anomalies nuclears dels eritròcits, els valors de CHQ van oscil·lar entre 14,92 i 97,00, cosa que indica que la cipermetrina tenia un risc genotòxic potencial per a P. gracilis fins i tot al seu hàbitat natural. Tenint en compte la mortalitat, la concentració màxima de compostos xenobiòtics tolerable a P. gracilis va ser de 4,24 μg L−1. Tanmateix, concentracions tan baixes com 1 μg/L també van mostrar efectes genotòxics. Aquest fet pot provocar un augment del nombre d'individus anormals57 i afectar el desenvolupament i la reproducció de les espècies als seus hàbitats, provocant una disminució de les poblacions d'amfibis.
Les formulacions comercials de l'insecticida cipermetrina van mostrar una alta toxicitat aguda i crònica per a P. gracilis. Es van observar taxes de mortalitat més elevades, probablement a causa dels efectes tòxics, com ho demostra la presència de micronuclis i anomalies nuclears d'eritròcits, especialment nuclis serrats, nuclis lobulats i nuclis vesiculars. A més, les espècies estudiades presentaven un augment dels riscos ambientals, tant aguts com crònics. Aquestes dades, combinades amb estudis anteriors del nostre grup d'investigació, van demostrar que fins i tot diferents formulacions comercials de cipermetrina encara causaven una disminució de les activitats de l'acetilcolinesterasa (AChE) i la butirilcolinesterasa (BChE) i estrès oxidatiu58, i van provocar canvis en l'activitat de natació i malformacions orals59 a P. gracilis, cosa que indica que les formulacions comercials de subtoxicitat i subtoxicitat letals a la letal·lerina són elevades. aquesta espècie. Hartmann et al. 60 van trobar que les formulacions comercials de cipermetrina eren les més tòxiques per a P. gracilis i una altra espècie del mateix gènere (P. cuvieri) en comparació amb altres nou pesticides. Això suggereix que les concentracions aprovades legalment de cipermetrina per a la protecció del medi ambient poden provocar una alta mortalitat i una disminució de la població a llarg termini.
Es necessiten més estudis per avaluar la toxicitat del plaguicida per als amfibis, ja que les concentracions que es troben al medi ambient poden causar una mortalitat elevada i suposar un risc potencial per a P. gracilis. S'ha de fomentar la investigació sobre espècies d'amfibis, ja que les dades sobre aquests organismes són escasses, especialment sobre les espècies brasileres.
La prova de toxicitat crònica va durar 168 h (7 dies) en condicions estàtiques i les concentracions subletals van ser: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. En ambdós experiments, es van avaluar 10 capgrossos per grup de tractament amb sis rèpliques, per a un total de 60 capgrossos per concentració. Mentrestant, el tractament només amb aigua va servir de control negatiu. Cada configuració experimental consistia en un plat de vidre estèril amb una capacitat de 500 ml i una densitat d'1 capgròs per 50 ml de solució. El matràs es va cobrir amb una pel·lícula de polietilè per evitar l'evaporació i es va airejar contínuament.
L'aigua es va analitzar químicament per determinar les concentracions de pesticides a 0, 96 i 168 h. Segons Sabin et al. 68 i Martins et al. 69 , les anàlisis es van realitzar al Laboratori d'Anàlisi de Plaguicides (LARP) de la Universitat Federal de Santa Maria mitjançant cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses triple quadrupol (model Varian 1200, Palo Alto, Califòrnia, EUA). La determinació quantitativa de pesticides a l'aigua es mostra com a material suplementari (Taula SM1).
Per a la prova del micronucli (MNT) i la prova d'anormalitat nuclear dels glòbuls vermells (ARN), es van analitzar 15 capgrossos de cada grup de tractament. Els capgrossos es van anestesiar amb lidocaïna al 5% (50 mg g-170) i es van recollir mostres de sang mitjançant punció cardíaca mitjançant xeringues heparinitzades d'un sol ús. Els frotis de sang es van preparar en portaobjectes de microscopi estèrils, es van assecar a l'aire, es van fixar amb metanol al 100% (4 ° C) durant 2 minuts i després es van tacar amb una solució de Giemsa al 10% durant 15 minuts a la foscor. Al final del procés, les diapositives es van rentar amb aigua destil·lada per eliminar l'excés de taca i es van assecar a temperatura ambient.
Es van analitzar almenys 1000 glòbuls vermells de cada capgròs mitjançant un microscopi de 100 × amb un objectiu de 71 per determinar la presència de MN i ENA. Es van avaluar un total de 75.796 glòbuls vermells de capgrossos tenint en compte les concentracions i els controls de cipermetrina. La genotoxicitat es va analitzar segons el mètode de Carrasco et al. i Fenech et al.38,72 determinant la freqüència de les lesions nuclears següents: (1) cèl·lules anucleades: cèl·lules sense nucli; (2) cèl·lules apoptòtiques: fragmentació nuclear, mort cel·lular programada; (3) cèl·lules binucleades: cèl·lules amb dos nuclis; (4) gemmes nuclears o cèl·lules ampolla: cèl·lules amb nuclis amb petites protuberàncies de la membrana nuclear, ampolles de mida similar als micronuclis; (5) cèl·lules cariolitzades: cèl·lules amb només el contorn del nucli sense material intern; (6) cèl·lules dentades: cèl·lules amb nuclis amb esquerdes o osques evidents en la seva forma, també anomenades nuclis en forma de ronyó; (7) cèl·lules lobulades: cèl·lules amb protuberàncies nuclears més grans que les esmentades vesícules; i (8) microcèl·lules: cèl·lules amb nuclis condensats i citoplasma reduït. Els canvis es van comparar amb els resultats del control negatiu.
Els resultats de les proves de toxicitat aguda (LC50) es van analitzar mitjançant el programari GBasic i el mètode TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Les dades de la prova crònica es van provar prèviament per a la normalitat de l'error (Shapiro-Wilks) i l'homogeneïtat de la variància (Bartlett). Els resultats es van analitzar mitjançant l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA). La prova de Tukey es va utilitzar per comparar dades entre ells, i la prova de Dunnett es va utilitzar per comparar les dades entre el grup de tractament i el grup de control negatiu.
Les dades LOEC i NOEC es van analitzar mitjançant el test de Dunnett. Les proves estadístiques es van realitzar mitjançant el programari Statistica 8.0 (StatSoft) amb un nivell de significació del 95% (p <0,05).
Hora de publicació: 13-mar-2025