Aquest estudi va avaluar la letalitat, la subletalitat i la toxicitat dels productes comercials.cipermetrinaformulacions per a capgrossos anurans. En la prova aguda, es van provar concentracions de 100–800 μg/L durant 96 h. En la prova crònica, es van provar concentracions de cipermetrina naturals (1, 3, 6 i 20 μg/L) per determinar la mortalitat, seguides de proves de micronuclis i anomalies nuclears dels glòbuls vermells durant 7 dies. La CL50 de la formulació comercial de cipermetrina per a capgrossos va ser de 273,41 μg L−1. En la prova crònica, la concentració més alta (20 μg L−1) va resultar en una mortalitat superior al 50%, ja que va matar la meitat dels capgrossos provats. La prova de micronuclis va mostrar resultats significatius a 6 i 20 μg L−1 i es van detectar diverses anomalies nuclears, cosa que indica que la formulació comercial de cipermetrina té un potencial genotòxic contra P. gracilis. La cipermetrina és un alt risc per a aquesta espècie, cosa que indica que pot causar múltiples problemes i afectar la dinàmica d'aquest ecosistema a curt i llarg termini. Per tant, es pot concloure que les formulacions comercials de cipermetrina tenen efectes tòxics sobre P. gracilis.
A causa de l'expansió contínua de les activitats agrícoles i l'aplicació intensiva decontrol de plaguesmesures, els animals aquàtics estan exposats amb freqüència a pesticides1,2. La contaminació dels recursos hídrics prop dels camps agrícoles pot afectar el desenvolupament i la supervivència d'organismes no objectiu, com ara els amfibis.
Els amfibis són cada cop més importants en l'avaluació de matrius ambientals. Els anurs es consideren bons bioindicadors de contaminants ambientals a causa de les seves característiques úniques, com ara cicles de vida complexos, taxes de creixement larvari ràpides, estat tròfic, pell permeable10,11, dependència de l'aigua per a la reproducció12 i ous sense protecció11,13,14. S'ha demostrat que la granota d'aigua petita (Physalaemus gracilis), coneguda comunament com a granota ploranera, és una espècie bioindicadora de contaminació per pesticides4,5,6,7,15. L'espècie es troba en aigües estancades, zones protegides o zones amb hàbitat variable a l'Argentina, l'Uruguai, el Paraguai i el Brasil1617 i es considera estable per la classificació de la UICN a causa de la seva àmplia distribució i tolerància a diferents hàbitats18.
S'han reportat efectes subletals en amfibis després de l'exposició a la cipermetrina, incloent-hi canvis comportamentals, morfològics i bioquímics en els capgrossos23,24,25, alteració de la mortalitat i el temps de metamorfosi, canvis enzimàtics, disminució de l'èxit d'eclosió24,25, hiperactivitat26, inhibició de l'activitat de la colinesterasa27 i canvis en el rendiment de la natació7,28. Tanmateix, els estudis sobre els efectes genotòxics de la cipermetrina en els amfibis són limitats. Per tant, és important avaluar la susceptibilitat de les espècies d'anurs a la cipermetrina.
La contaminació ambiental afecta el creixement i desenvolupament normal dels amfibis, però l'efecte advers més greu és el dany genètic a l'ADN causat per l'exposició a pesticides13. L'anàlisi de la morfologia de les cèl·lules sanguínies és un bioindicador important de la contaminació i la toxicitat potencial d'una substància per a les espècies salvatges29. La prova del micronucli és un dels mètodes més utilitzats per determinar la genotoxicitat dels productes químics en el medi ambient30. És un mètode ràpid, eficaç i econòmic que és un bon indicador de la contaminació química d'organismes com els amfibis31,32 i pot proporcionar informació sobre l'exposició a contaminants genotòxics33.
L'objectiu d'aquest estudi va ser avaluar el potencial tòxic de les formulacions comercials de cipermetrina per a petits capgrossos aquàtics mitjançant una prova de micronuclis i una avaluació de riscos ecològics.
Mortalitat acumulada (%) de capgrossos de *P. gracilis* exposats a diferents concentracions de cipermetrina comercial durant el període agut de la prova.
Mortalitat acumulada (%) de capgrossos de *P. gracilis* exposats a diferents concentracions de cipermetrina comercial durant una prova crònica.
L'alta mortalitat observada va ser el resultat d'efectes genotòxics en amfibis exposats a diferents concentracions de cipermetrina (6 i 20 μg/L), com ho demostra la presència de micronuclis (MN) i anomalies nuclears en els eritròcits. La formació de MN indica errors en la mitosi i s'associa amb una mala unió dels cromosomes als microtúbuls, defectes en els complexos proteics responsables de l'absorció i el transport dels cromosomes, errors en la segregació cromosòmica i errors en la reparació del dany a l'ADN38,39 i pot estar relacionada amb l'estrès oxidatiu induït per pesticides40,41. Es van observar altres anomalies en totes les concentracions avaluades. L'augment de les concentracions de cipermetrina va augmentar les anomalies nuclears en els eritròcits en un 5% i un 20% a les dosis més baixes (1 μg/L) i més altes (20 μg/L), respectivament. Per exemple, els canvis en l'ADN d'una espècie poden tenir conseqüències greus tant per a la supervivència a curt com a llarg termini, resultant en disminució de la població, alteració de l'aptitud reproductiva, consanguinitat, pèrdua de diversitat genètica i alteració de les taxes de migració. Tots aquests factors poden afectar la supervivència i el manteniment de les espècies42,43. La formació d'anomalies eritroides pot indicar un bloqueig en la citocinesi, que resulta en una divisió cel·lular anormal (eritròcits binucleats)44,45; els nuclis multilobulats són protuberàncies de la membrana nuclear amb múltiples lòbuls46, mentre que altres anomalies eritroides poden estar associades a l'amplificació de l'ADN, com ara els ronyons/vesicules nuclears47. La presència d'eritròcits anucleats pot indicar un transport d'oxigen deteriorat, especialment en aigua contaminada48,49. L'apoptosi indica la mort cel·lular50.
Altres estudis també han demostrat els efectes genotòxics de la cipermetrina. Kabaña et al.51 van demostrar la presència de micronuclis i canvis nuclears com ara cèl·lules binucleades i cèl·lules apoptòtiques en cèl·lules d'Odontophrynus americanus després de l'exposició a altes concentracions de cipermetrina (5000 i 10.000 μg L−1) durant 96 h. També es va detectar apoptosi induïda per cipermetrina en P. biligonigerus52 i Rhinella arenarum53. Aquests resultats suggereixen que la cipermetrina té efectes genotòxics en una sèrie d'organismes aquàtics i que l'assaig MN i ENA pot ser un indicador d'efectes subletals sobre els amfibis i pot ser aplicable a espècies autòctones i poblacions salvatges exposades a tòxics12.
Les formulacions comercials de cipermetrina representen un alt risc ambiental (tant agut com crònic), amb concentracions de concentració alta (HQ) que superen el nivell de l'Agència de Protecció Ambiental dels Estats Units (EPA)54, cosa que pot afectar negativament l'espècie si és present al medi ambient. En l'avaluació del risc crònic, el NOEC per a la mortalitat va ser de 3 μg L−1, cosa que confirma que les concentracions trobades a l'aigua poden representar un risc per a l'espècie55. El NOEC letal per a les larves de R. arenarum exposades a una barreja d'endosulfà i cipermetrina va ser de 500 μg L−1 després de 168 h; aquest valor va disminuir a 0,0005 μg L−1 després de 336 h. Els autors mostren que com més llarga és l'exposició, més baixes són les concentracions nocives per a l'espècie. També és important destacar que els valors de NOEC van ser superiors als de P. gracilis al mateix temps d'exposició, cosa que indica que la resposta de l'espècie a la cipermetrina és específica de l'espècie. A més, pel que fa a la mortalitat, el valor de CHQ de P. gracilis després de l'exposició a la cipermetrina va arribar a 64,67, que és superior al valor de referència establert per l'Agència de Protecció Ambiental dels EUA54, i el valor de CHQ de les larves de R. arenarum també va ser superior a aquest valor (CHQ > 388,00 després de 336 h), cosa que indica que els insecticides estudiats representen un alt risc per a diverses espècies d'amfibis. Tenint en compte que P. gracilis necessita aproximadament 30 dies per completar la metamorfosi56, es pot concloure que les concentracions estudiades de cipermetrina poden contribuir al declivi de la població en impedir que els individus infectats entrin a la fase adulta o reproductiva a una edat primerenca.
En l'avaluació calculada del risc de micronuclis i altres anomalies nuclears d'eritròcits, els valors de CHQ van oscil·lar entre 14,92 i 97,00, cosa que indica que la cipermetrina tenia un risc genotòxic potencial per a P. gracilis fins i tot en el seu hàbitat natural. Tenint en compte la mortalitat, la concentració màxima de compostos xenobiòtics tolerables per a P. gracilis va ser de 4,24 μg L−1. Tanmateix, concentracions tan baixes com 1 μg/L també van mostrar efectes genotòxics. Aquest fet pot conduir a un augment del nombre d'individus anormals57 i afectar el desenvolupament i la reproducció de les espècies en els seus hàbitats, provocant una disminució de les poblacions d'amfibis.
Les formulacions comercials de l'insecticida cipermetrina van mostrar una alta toxicitat aguda i crònica per a P. gracilis. Es van observar taxes de mortalitat més altes, probablement a causa d'efectes tòxics, com ho demostra la presència de micronuclis i anomalies nuclears d'eritròcits, especialment nuclis serrats, nuclis lobulats i nuclis vesiculars. A més, les espècies estudiades van mostrar un augment dels riscos ambientals, tant aguts com crònics. Aquestes dades, combinades amb estudis previs del nostre grup de recerca, van mostrar que fins i tot diferents formulacions comercials de cipermetrina encara causaven una disminució de les activitats de l'acetilcolinesterasa (AChE) i la butirilcolinesterasa (BChE) i estrès oxidatiu58, i van provocar canvis en l'activitat de natació i malformacions orals59 en P. gracilis, cosa que indica que les formulacions comercials de cipermetrina tenen una alta toxicitat letal i subletal per a aquesta espècie. Hartmann et al. 60 van trobar que les formulacions comercials de cipermetrina eren les més tòxiques per a P. gracilis i una altra espècie del mateix gènere (P. cuvieri) en comparació amb altres nou pesticides. Això suggereix que les concentracions legalment aprovades de cipermetrina per a la protecció del medi ambient poden provocar una alta mortalitat i un descens de la població a llarg termini.
Calen més estudis per avaluar la toxicitat del pesticida per als amfibis, ja que les concentracions que es troben al medi ambient poden causar una alta mortalitat i representar un risc potencial per a P. gracilis. Cal fomentar la recerca sobre espècies d'amfibis, ja que les dades sobre aquests organismes són escasses, especialment sobre les espècies brasileres.
La prova de toxicitat crònica va durar 168 h (7 dies) en condicions estàtiques i les concentracions subletals van ser: 1, 3, 6 i 20 μg ai L−1. En ambdós experiments, es van avaluar 10 capgrossos per grup de tractament amb sis rèpliques, per a un total de 60 capgrossos per concentració. Mentrestant, el tractament només amb aigua va servir com a control negatiu. Cada configuració experimental consistia en una placa de vidre estèril amb una capacitat de 500 ml i una densitat d'1 capgrosso per 50 ml de solució. El matràs es va cobrir amb una pel·lícula de polietilè per evitar l'evaporació i es va airejar contínuament.
L'aigua es va analitzar químicament per determinar les concentracions de pesticides a les 0, 96 i 168 h. Segons Sabin et al. 68 i Martins et al. 69, les anàlisis es van dur a terme al Laboratori d'Anàlisi de Pesticides (LARP) de la Universitat Federal de Santa Maria mitjançant cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses de triple quadrupol (Varian model 1200, Palo Alto, Califòrnia, EUA). La determinació quantitativa de pesticides a l'aigua es mostra com a material suplementari (Taula SM1).
Per a la prova de micronuclis (MNT) i la prova d'anomalia nuclear dels glòbuls vermells (ARN), es van analitzar 15 capgrossos de cada grup de tractament. Els capgrossos es van anestesiar amb lidocaïna al 5% (50 mg g-170) i es van recollir mostres de sang mitjançant punció cardíaca utilitzant xeringues heparinades d'un sol ús. Es van preparar frotis de sang en portaobjectes de microscopi estèrils, es van assecar a l'aire, es van fixar amb metanol al 100% (4 °C) durant 2 min i després es van tenyir amb solució de Giemsa al 10% durant 15 min a la foscor. Al final del procés, els portaobjectes es van rentar amb aigua destil·lada per eliminar l'excés de tinció i es van assecar a temperatura ambient.
Es van analitzar almenys 1000 eritròcits de cada capgròs mitjançant un microscopi de 100× amb un objectiu de 71 per determinar la presència de MN i ENA. Es van avaluar un total de 75.796 eritròcits de capgrossos considerant concentracions de cipermetrina i controls. La genotoxicitat es va analitzar segons el mètode de Carrasco et al. i Fenech et al.38,72 determinant la freqüència de les següents lesions nuclears: (1) cèl·lules anucleades: cèl·lules sense nucli; (2) cèl·lules apoptòtiques: fragmentació nuclear, mort cel·lular programada; (3) cèl·lules binucleades: cèl·lules amb dos nuclis; (4) brots nuclears o cèl·lules de la bleba: cèl·lules amb nuclis amb petites protuberàncies de la membrana nuclear, blebes de mida similar als micronuclis; (5) cèl·lules cariolitzades: cèl·lules amb només el contorn del nucli sense material intern; (6) cèl·lules amb osques: cèl·lules amb nuclis amb esquerdes o osques evidents en la seva forma, també anomenades nuclis en forma de ronyó; (7) cèl·lules lobulades: cèl·lules amb protuberàncies nuclears més grans que les vesícules esmentades anteriorment; i (8) microcèl·lules: cèl·lules amb nuclis condensats i citoplasma reduït. Els canvis es van comparar amb els resultats del control negatiu.
Els resultats de les proves de toxicitat aguda (LC50) es van analitzar mitjançant el programari GBasic i el mètode TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Les dades de les proves cròniques es van sotmetre a proves prèvies per a la normalitat d'errors (Shapiro-Wilks) i l'homogeneïtat de la variància (Bartlett). Els resultats es van analitzar mitjançant l'anàlisi de la variància unidireccional (ANOVA). Es va utilitzar la prova de Tukey per comparar les dades entre si i la prova de Dunnett per comparar les dades entre el grup de tractament i el grup de control negatiu.
Les dades de LOEC i NOEC es van analitzar mitjançant la prova de Dunnett. Les proves estadístiques es van realitzar amb el programari Statistica 8.0 (StatSoft) amb un nivell de significació del 95% (p < 0,05).
Data de publicació: 13 de març de 2025