Materials vegetals i patògens
El Dr. Pat Brown de la Universitat d'Illinois (ara a la UC Davis) va proporcionar una població de mapatge d'associacions de sorgo coneguda com a població de conversió de sorgo (SCP). Ja s'ha descrit anteriorment i és una col·lecció de línies diverses convertides a insensibilitat al fotoperíode i menor estatura per facilitar el creixement i desenvolupament de les plantes en entorns dels EUA. En aquest estudi es van utilitzar 510 línies d'aquesta població, tot i que, a causa de la mala germinació i altres problemes de control de qualitat, no totes les línies es van utilitzar en l'anàlisi dels tres trets. Finalment, es van utilitzar dades de 345 línies per a l'anàlisi de la resposta a la quitina, 472 línies per a la resposta a flg22 i 456 per a la resistència a TLS.B. cookeiLa soca LSLP18 es va obtenir del Dr. Burt Bluhm de la Universitat d'Arkansas.
Mesura de la resposta MAMP
En aquest estudi es van utilitzar dos MAMP diferents flg22, (catàleg Genscript núm. RP19986) i quitina. Les plantes de sorgo es van cultivar en inserts col·locats sobre plans plens de terra (33% de Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) a l'hivernacle. Les plantes es van regar el dia abans de la recollida de la mostra per evitar la humitat addicional de les fulles el dia de la recollida.
Les línies es van aleatoritzar i, per raons logístiques, es van plantar en lots de 60 línies. Per a cada línia, es van plantar tres "testos" amb dues llavors per línia. Els lots posteriors es van plantar tan bon punt es va processar el lot anterior fins que es va avaluar tota la població. Es van dur a terme dues proves experimentals per a tots dos MAMP amb genotips re-aleatoritzats en cadascuna de les dues proves.
Els assaigs de ROS es van dur a terme tal com s'ha descrit anteriorment. Breument, per a cada línia, es van plantar sis llavors en 3 testos diferents. De les plàntules resultants, se'n van seleccionar tres en funció de la uniformitat. No es van utilitzar les plàntules que semblaven inusuals o que eren significativament més altes o més baixes que la majoria. Es van excisar quatre discs de fulles de 3 mm de diàmetre de la part més ampla de la quarta fulla de tres plantes de sorgo diferents de 15 dies. Un disc per fulla de dues plantes i dos discs d'una planta, i el segon disc es va convertir en el control d'aigua (vegeu més avall). Els discs es van deixar flotar individualment sobre 50 µl d'H20 en una placa negra de 96 pous, es van segellar amb un segell d'alumini per evitar l'exposició a la llum i es van mantenir a temperatura ambient durant la nit. L'endemà al matí es va preparar una solució de reacció utilitzant una sonda quimioluminescent L-012 (Wako, catàleg núm. 120-04891) de 2 mg/ml, peroxidasa de rave picant de 2 mg/ml (tipus VI-A, Sigma-Aldrich, catàleg núm. P6782) i 100 mg/ml de quitina o 2 μM de Flg22. Es van afegir 50 µl d'aquesta solució de reacció a tres dels quatre pous. El quart pou era un control simulat, al qual es va afegir la solució de reacció que excloïa el MAMP. També es van incloure quatre pous en blanc que només contenien aigua a cada placa.
Després d'afegir la solució de reacció, la luminescència es va mesurar amb el lector de microplaques multidetecció Synergy™ 2 (BioTek) cada 2 minuts durant 1 hora. El lector de plaques pren mesures de luminescència cada 2 minuts durant aquesta hora. Es va calcular la suma de les 31 lectures per obtenir el valor de cada pou. El valor estimat de la resposta MAMP per a cada genotip es va calcular com a (valor mitjà de luminescència dels tres pous experimentals: el valor del pou simulat) menys el valor mitjà del pou en blanc. Els valors del pou en blanc van ser constantment propers a zero.
Discs de fulles deNicotiana benthamiana, també es van incloure una línia de sorgo d'alta resposta (SC0003) i una línia de sorgo de baixa resposta (PI 6069) com a controls a cada placa de 96 pous amb finalitats de control de qualitat.
B. cookeipreparació i inoculació de l'inocul
B. cookeiL'inocul es va preparar tal com s'ha descrit anteriorment. Breument, els grans de sorgo es van submergir en aigua durant tres dies, es van esbandir, es van abocar en matrassos cònics d'1 L i es van autoclavar durant una hora a 15 psi i 121 °C. A continuació, els grans es van inocular amb uns 5 ml de miceli macerat d'un cultiu fresc deB. cookeiEls aïllats LSLP18 es van deixar durant 2 setmanes a temperatura ambient, agitant els matrassos cada 3 dies. Després de 2 setmanes, els grans de sorgo infestats amb fongs es van assecar a l'aire i després es van emmagatzemar a 4 °C fins a la inoculació al camp. Es va utilitzar el mateix inòcul durant tot l'assaig i es va refrescar cada any. Per a la inoculació, es van col·locar de 6 a 10 grans infestats a la spiral de plantes de sorgo de 4 a 5 setmanes. Les espores produïdes per aquests fongs van iniciar la infecció a les plantes de sorgo joves en una setmana.
Preparació de llavors
Abans de plantar-les al camp, les llavors de sorgo es van tractar amb una barreja de fungicida, insecticida i protector contra la sequera que contenia ~1% de fungicida Spirato 480 FS, 4% de fungicida Sebring 480 FS i 3% de protector contra la sequera Sorpro 940 ES. A continuació, les llavors es van assecar a l'aire durant 3 dies, cosa que va proporcionar una fina capa d'aquesta barreja al voltant de les llavors. El protector va permetre l'ús de l'herbicida Dual Magnum com a tractament de preemergència.
Avaluació de la resistència a la taca foliar objectiu
El SCP es va plantar a l'Estació Central de Recerca de Cultius a Clayton, Carolina del Nord, el 14 i 15 de juny de 2017 i el 20 de juny de 2018 en un disseny de blocs complets aleatoris amb dues rèpliques experimentals en cada cas. Els experiments es van plantar en files individuals d'1,8 m amb una amplada de fila de 0,9 m utilitzant 10 llavors per parcel·la. Es van plantar dues files de vora al voltant de la perifèria de cada experiment per evitar efectes de vora. Els experiments es van inocular el 20 de juliol de 2017 i el 20 de juliol de 2018, moment en què les plantes de sorgo es trobaven en l'etapa de creixement 3. Les qualificacions es van prendre en escales d'un a nou, on les plantes que no mostraven signes de malaltia es van puntuar amb un nou i les plantes completament mortes es van puntuar amb un. Es van prendre dues qualificacions el 2017 i quatre lectures el 2018 començant dues setmanes després de la inoculació cada any. L'sAUDPC (àrea estandarditzada sota la corba de progressió de la malaltia) es va calcular tal com s'ha descrit anteriorment.
Data de publicació: 01 d'abril de 2021