Materials vegetals i patògens
El Dr. Pat Brown de la Universitat d'Illinois (ara a UC Davis) va proporcionar una població de mapes d'associació de sorgo coneguda com a població de conversió de sorgo (SCP). S'ha descrit anteriorment i és una col·lecció de línies diverses convertides en insensibilitat al fotoperíode i menor estatura per facilitar el creixement i desenvolupament de les plantes en entorns nord-americans. En aquest estudi es van utilitzar 510 línies d'aquesta població, tot i que a causa de la mala germinació i altres problemes de control de qualitat, no es van utilitzar totes les línies en l'anàlisi dels tres trets. Finalment, es van utilitzar dades de 345 línies per a l'anàlisi de la resposta de quitina, 472 línies per a la resposta flg22 i 456 per a la resistència TLS.B. cookeila soca LSLP18 es va obtenir del Dr. Burt Bluhm de la Universitat d'Arkansas.
Mesura de la resposta MAMP
En aquest estudi es van utilitzar dos MAMP diferents, flg22 (catàleg Genscript # RP19986) i quitina. Les plantes de sorgo es van cultivar en insercions col·locades en plans plens de terra (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) a l'hivernacle. Les plantes es van regar el dia abans de la recollida de mostres per evitar una humitat addicional de les fulles el dia de la recollida.
Les línies van ser aleatòries i, per motius logístics, es van plantar en lots de 60 línies. Per a cada línia, es van plantar tres "tests" amb dues llavors per línia. Els lots posteriors es van plantar tan bon punt s'havia processat el lot anterior fins a valorar tota la població. Es van realitzar dues execucions experimentals per als dos MAMP amb genotips re-aleatoritzats en cadascuna de les dues execucions.
Els assajos de ROS es van dur a terme tal com es va descriure anteriorment. Breument, per a cada línia, es van plantar sis llavors en 3 tests diferents. De les plàntules resultants, se'n van seleccionar tres segons la uniformitat. No es van utilitzar plàntules que semblaven inusuals o que eren significativament més altes o més baixes que la majoria. Es van extreure quatre discos de fulles de 3 mm de diàmetre de la part més ampla de la quarta fulla de tres plantes diferents de sorgo de 15 dies. Un disc per fulla de dues plantes i dos discos d'una planta, amb el segon disc convertint-se en el control de l'aigua (vegeu més avall). Els discos es van flotar individualment sobre 50 µl d'H20 en una placa negra de 96 pous, es van segellar amb un segell d'alumini per evitar l'exposició a la llum i es van mantenir a temperatura ambient durant la nit. L'endemà al matí es va fer una solució de reacció utilitzant una sonda quimioluminiscent L-012 de 2 mg/ml (Wako, catàleg # 120-04891), 2 mg/ml de peroxidasa de rave picant (tipus VI-A, Sigma-Aldrich, catàleg # P6782) i 100 mg/ml de quitina o 2 μM de Flg22. Es van afegir 50 µl d'aquesta solució de reacció a tres dels quatre pous. El quart pou era un control simulat, al qual es va afegir la solució de reacció excloent el MAMP. També es van incloure quatre pous en blanc que contenien només aigua a cada placa.
Després d'afegir la solució de reacció, es va mesurar la luminescència mitjançant el lector de microplaques de detecció múltiple SynergyTM 2 (BioTek) cada 2 minuts durant 1 h. El lector de plaques fa mesures de luminescència cada 2 min durant aquesta 1 h. La suma de les 31 lectures es va calcular per donar el valor de cada pou. El valor estimat de la resposta MAMP per a cada genotip es va calcular com a (valor mitjà de luminescència dels tres pous experimentals: el valor del pou simulat) menys el valor mitjà del pou en blanc. Els valors del pou en blanc eren constantment propers a zero.
Discs de fulla deNicotiana benthamiana, una línia de sorgo d'alta resposta (SC0003) i una línia de sorgo de baixa resposta (PI 6069) també es van incloure com a controls a cada placa de 96 pous amb finalitats de control de qualitat.
B. cookeipreparació i inoculació d'inòcul
B. cookeil'inòcul es va preparar tal com s'ha descrit anteriorment. Breument, els grans de sorgo es van remullar amb aigua durant tres dies, es van esbandir, es van recollir en matràs cònics d'1 litre i es van autoclauar durant una hora a 15 psi i 121 ° C. A continuació, es van inocular els grans amb uns 5 ml de micelia macerada d'un cultiu fresc deB. cookeiLSLP18 aïlla i es deixa durant 2 setmanes a temperatura ambient, agitant els flascons cada 3 dies. Després de 2 setmanes, els grans de sorgo infestats per fongs es van assecar a l'aire i després es van emmagatzemar a 4 ° C fins a la inoculació al camp. El mateix inòcul es va utilitzar durant tot l'assaig i es va fer fresc cada any. Per a la inoculació, es van col·locar de 6 a 10 grans infestats a l'espiral de plantes de sorgo de 4 a 5 setmanes. Les espores produïdes a partir d'aquests fongs van iniciar la infecció a les plantes joves de sorgo en una setmana.
Preparació de llavors
Abans de plantar al camp, la llavor de sorgo es va tractar amb una barreja de fungicida, insecticida i protector que contenia ~ 1% de fungicida Spirato 480 FS, 4% de fungicida Sebring 480 FS, 3% de protector de llavors Sorpro 940 ES. A continuació, les llavors es van assecar a l'aire durant 3 dies, cosa que va proporcionar una fina capa d'aquesta barreja al voltant de les llavors. El protector va permetre l'ús de l'herbicida Dual Magnum com a tractament de pre-emergència.
Avaluació de la resistència a les taques de fulla objectiu
El SCP es va plantar a la Central Crops Research Station de Clayton, Carolina del Nord, del 14 al 15 de juny de 2017 i el 20 de juny de 2018 en un disseny de bloc complet aleatoritzat amb dues rèpliques experimentals en cada cas. Els experiments es van plantar en files individuals d'1,8 m amb una amplada de filera de 0,9 m amb 10 llavors per parcel·la. Es van plantar dues files de vora al voltant de la perifèria de cada experiment per evitar efectes de vora. Els experiments es van inocular el 20 de juliol de 2017 i el 20 de juliol de 2018, moment en què les plantes de sorgo es trobaven en l'etapa de creixement 3. Les valoracions es van prendre en una escala d'1 a nou, on les plantes que no mostraven signes de malaltia es van puntuar com a nou i completament. les plantes mortes es van puntuar com una sola. Es van fer dues classificacions el 2017 i quatre lectures el 2018 a partir de dues setmanes després de la inoculació cada any. sAUDPC (àrea estandarditzada sota la corba de progressió de la malaltia) es va calcular tal com es va descriure anteriorment.
Hora de publicació: 01-abril-2021