El nematode del pi és un endoparàsit migratori de quarantena conegut per causar greus pèrdues econòmiques en els ecosistemes de pinedes. El present estudi revisa l'activitat nematicida dels indols halogenats contra els nematodes del pi i el seu mecanisme d'acció. Les activitats nematicides del 5-iodoindol i l'avermectina (control positiu) contra els nematodes del pi van ser similars i altes a baixes concentracions (10 μg/mL). El 5-iodoindol va reduir la fecunditat, l'activitat reproductiva, la mortalitat embrionària i larvària i el comportament locomotor. Les interaccions moleculars dels lligands amb receptors de canals de clorur controlats per glutamat específics d'invertebrats donen suport a la idea que el 5-iodoindol, com l'avermectina, s'uneix fortament al lloc actiu del receptor. El 5-iodoindol també va induir diverses deformacions fenotípiques en els nematodes, incloent-hi el col·lapse/contracció anormal d'òrgans i l'augment de la vacuolització. Aquests resultats suggereixen que els vacúols poden tenir un paper en la mort mediada per metilació dels nematodes. És important destacar que el 5-iodoindol no va ser tòxic per a cap de les espècies vegetals (col i rave). Per tant, aquest estudi demostra que l'aplicació de iodoindol en condicions ambientals pot controlar els danys per marciment del pi.
El nematode de la fusta del pi (Bursaphelenchus xylophilus) pertany als nematodes de la fusta del pi (PWN), nematodes endoparàsits migratoris coneguts per causar greus danys ecològics als ecosistemes dels boscos de pins1. La malaltia de la marciment del pi (PWD) causada pel nematode de la fusta del pi s'està convertint en un problema greu en diversos continents, incloent-hi Àsia i Europa, i a Amèrica del Nord, el nematode destrueix les espècies de pins introduïdes1,2. El declivi dels pins és un problema econòmic important, i la perspectiva de la seva propagació global és preocupant3. Les següents espècies de pins són les més atacades pel nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. El nematode del pi és una malaltia greu que pot matar pins en setmanes o mesos després de la infecció. A més, els brots de nematodes del pi són comuns en una varietat d'ecosistemes, per la qual cosa s'han establert cadenes d'infecció persistents1.
El Bursaphelenchus xylophilus és un nematode paràsit de plantes de quarantena que pertany a la superfamília Aphelenchoidea i al clade 102.5. El nematode s'alimenta de fongs i es reprodueix en els teixits de fusta dels pins, desenvolupant-se en quatre estadis larvaris diferents: L1, L2, L3, L4 i un individu adult1,6. En condicions d'escassetat d'aliments, el nematode del pi passa a un estadi larvari especialitzat (dauer), que parasita el seu vector (l'escarabat de l'escorça del pi) (Monochamus alternatus) i es transfereix a pins sans. En hostes sans, els nematodes migren ràpidament a través dels teixits vegetals i s'alimenten de cèl·lules parenquimatoses, cosa que provoca diverses reaccions d'hipersensibilitat, marciment del pi i mort en un any després de la infecció1,7,8.
El control biològic dels nematodes del pi ha estat durant molt de temps un repte, amb mesures de quarantena que es remunten al segle XX. Les estratègies actuals per controlar els nematodes del pi impliquen principalment tractaments químics, incloent-hi la fumigació de la fusta i la implantació de nematicides als troncs dels arbres. Els nematicides més utilitzats són l'avermectina i el benzoat d'avermectina, que pertanyen a la família de les avermectines. Aquests productes químics cars són altament eficaços contra moltes espècies de nematodes i es consideren segurs per al medi ambient9. Tanmateix, s'espera que l'ús repetit d'aquests nematicides creï una pressió de selecció que gairebé amb tota seguretat conduirà a l'aparició de nematodes del pi resistents, com s'ha demostrat per a diverses plagues d'insectes, com ara Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella i els nematodes Trichostrongylus colubriformis i Ostertagia circumcincta, que han desenvolupat gradualment resistència a les avermectines10,11,12. Per tant, cal estudiar regularment els patrons de resistència i analitzar contínuament els nematicides per trobar mesures alternatives, rendibles i respectuoses amb el medi ambient per controlar la depressió porcina. En les darreres dècades, diversos autors han proposat l'ús d'extractes de plantes, olis essencials i compostos volàtils com a agents de control de nematodes13,14,15,16.
Recentment hem demostrat l'activitat nematicida de l'indol, una molècula de senyalització intercel·lular i interregnes, en Caenorhabditis elegans 17. L'indol és un senyal intracel·lular generalitzat en l'ecologia microbiana, que controla nombroses funcions que afecten la fisiologia microbiana, la formació d'espores, l'estabilitat dels plasmidis, la resistència als fàrmacs, la formació de biofilms i la virulència 18, 19. No s'ha estudiat l'activitat de l'indol i els seus derivats contra altres nematodes patògens. En aquest estudi, hem investigat l'activitat nematicida de 34 indols contra els nematodes del pi i hem elucidat el mecanisme d'acció del 5-iodoindol més potent mitjançant microscòpia, fotografia a intervals i experiments d'acoblament molecular, i hem avaluat els seus efectes tòxics sobre les plantes mitjançant un assaig de germinació de llavors.
Anteriorment s'ha informat que altes concentracions (>1,0 mM) d'indol tenen un efecte nematicida sobre els nematodes17. Després del tractament de B. xylophilus (etapes vitals mixtes) amb indol o 33 derivats d'indol diferents a 1 mM, la mortalitat de B. xylophilus es va mesurar comptant els nematodes vius i morts en els grups de control i tractat. Cinc indols van mostrar una activitat nematicida significativa; la supervivència del grup de control no tractat va ser del 95 ± 7% després de 24 h. Dels 34 indols provats, el 5-iodoindol i el 4-fluoroindol a 1 mM van causar una mortalitat del 100%, mentre que el 5,6-difluoroindigo, el metilindol-7-carboxilat i el 7-iodoindol van causar una mortalitat d'aproximadament el 50% (Taula 1).
Efecte del 5-iodoindol sobre la formació de vacúols i el metabolisme del nematode de la fusta de pi. (A) Efecte de l'avermectina i el 5-iodoindol sobre nematodes mascles adults, (B) ous de nematode en estadi L1 i (C) metabolisme de B. xylophilus, (i) no es van observar vacúols a les 0 h, el tractament va provocar (ii) vacúols, (iii) acumulació de múltiples vacúols, (iv) inflor dels vacúols, (v) fusió dels vacúols i (vi) formació de vacúols gegants. Les fletxes vermelles indiquen inflor dels vacúols, les fletxes blaves indiquen la fusió dels vacúols i les fletxes negres indiquen vacúols gegants. Barra d'escala = 50 μm.
A més, aquest estudi també va descriure el procés seqüencial de mort induïda per metà en nematodes del pi (Figura 4C). La mort metanogènica és un tipus de mort cel·lular no apoptòtic associat amb l'acumulació de vacúols citoplasmàtics prominents27. Els defectes morfològics observats en els nematodes del pi semblen estar estretament relacionats amb el mecanisme de mort induïda per metà. L'examen microscòpic en diferents moments va mostrar que es van formar vacúols gegants després de 20 h d'exposició al 5-iodoindol (0,1 mM). Es van observar vacúols microscòpics després de 8 h de tractament i el seu nombre va augmentar després de 12 h. Es van observar diversos vacúols grans després de 14 h. Diversos vacúols fusionats eren clarament visibles després de 12-16 h de tractament, cosa que indica que la fusió de vacúols és la base del mecanisme de mort metanogènica. Després de 20 hores, es van trobar diversos vacúols gegants per tot el cuc. Aquestes observacions representen el primer informe de metuosi en C. elegans.
En els cucs tractats amb 5-iodoindol, també es va observar agregació i ruptura de vacúols (Fig. 5), com ho demostra la flexió dels cucs i l'alliberament de vacúols al medi ambient. També es va observar una disrupció de vacúols a la membrana de la closca de l'ou, que normalment es conserva intacta per L2 durant l'eclosió (Fig. suplementària S2). Aquestes observacions donen suport a la implicació de l'acumulació de líquids i la fallada osmoreguladora, així com la lesió cel·lular reversible (RCI), en el procés de formació i supuració de vacúols (Fig. 5).
Hipòtesi del paper del iode en la formació de vacúols observada, vam investigar l'activitat nematicida del iodur de sodi (NaI) i del iodur de potassi (KI). Tanmateix, a concentracions (0,1, 0,5 o 1 mM), no van afectar ni la supervivència dels nematodes ni la formació de vacúols (Figura suplementària S5), tot i que 1 mM de KI va tenir un lleuger efecte nematicida. D'altra banda, el 7-iodoindol (1 o 2 mM), com el 5-iodoindol, va induir múltiples vacúols i deformacions estructurals (Figura suplementària S6). Els dos iodoindols van mostrar característiques fenotípiques similars en els nematodes del pi, mentre que NaI i KI no. Curiosament, l'indol no va induir la formació de vacúols en B. xylophilus a les concentracions provades (dades no mostrades). Així, els resultats van confirmar que el complex indol-iode és responsable de la vacuolització i el metabolisme de B. xylophilus.
Entre els indols provats per a l'activitat nematicida, el 5-iodoindol va tenir l'índex de lliscament més alt de -5,89 kcal/mol, seguit del 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), el 4-fluoroindol (-4,33) i l'indol (-4,03) (Figura 6). El fort enllaç d'hidrogen de la cadena principal del 5-iodoindol a la leucina 218 estabilitza la seva unió, mentre que tots els altres derivats de l'indol s'uneixen a la serina 260 mitjançant enllaços d'hidrogen de la cadena lateral. Entre altres iodoindols modelats, el 2-iodoindol té un valor d'enllaç de -5,248 kcal/mol, que es deu al seu principal enllaç d'hidrogen amb la leucina 218. Altres enllaços coneguts inclouen el 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), el 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol) i el 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Figura suplementària S8). La majoria dels indols halogenats i el mateix indol, amb l'excepció del 5-iodoindol i el 2-iodoindol, formen un enllaç amb la serina 260. El fet que l'enllaç d'hidrogen amb la leucina 218 sigui indicatiu d'una unió eficient entre el receptor i el lligand, com s'ha observat per a la ivermectina (Fig. suplementària S7), confirma que el 5-iodoindol i el 2-iodoindol, com la ivermectina, s'uneixen fortament al lloc actiu del receptor GluCL a través de la leucina 218 (Fig. 6 i Fig. suplementària S8). Proposem que aquesta unió és necessària per mantenir l'estructura de porus oberts del complex GluCL i que, en unir-se fortament al lloc actiu del receptor GluCL, el 5-iodoindol, el 2-iodoindol, l'avermectina i la ivermectina mantenen el canal iònic obert i permeten l'absorció de fluids.
Acoblament molecular d'indol i indol halogenat a GluCL. Orientacions d'unió dels lligands (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol i (D) 5-iodoindol al centre actiu de GluCL. La proteïna està representada per una cinta, i els enllaços d'hidrogen de la cadena principal es mostren com a línies de punts grogues. (A′), (B′), (C′) i (D′) mostren les interaccions dels lligands corresponents amb els residus d'aminoàcids circumdants, i els enllaços d'hidrogen de la cadena lateral estan indicats per fletxes de punts roses.
Es van dur a terme experiments per avaluar l'efecte tòxic del 5-iodoindol sobre la germinació de llavors de col i rave. El 5-iodoindol (0,05 o 0,1 mM) o l'avermectina (10 μg/mL) van tenir poc o cap efecte sobre la germinació inicial i l'aparició de les plàntules (Figura 7). A més, no es va trobar cap diferència significativa entre la taxa de germinació dels controls no tractats i les llavors tractades amb 5-iodoindol o avermectina. L'efecte sobre l'elongació de l'arrel principal i el nombre d'arrels laterals formades va ser insignificant, tot i que 1 mM (10 vegades la seva concentració activa) de 5-iodoindol va retardar lleugerament el desenvolupament de les arrels laterals. Aquests resultats indiquen que el 5-iodoindol no és tòxic per a les cèl·lules vegetals i no interfereix amb els processos de desenvolupament de les plantes a les concentracions estudiades.
Efecte del 5-iodoindol sobre la germinació de les llavors. Germinació, brotació i arrelament lateral de les llavors de B. oleracea i R. raphanistrum en medi d'agar Murashige i Skoog amb o sense avermectina o 5-iodoindol. La germinació es va registrar després de 3 dies d'incubació a 22 °C.
Aquest estudi reporta diversos casos de matança de nematodes per indols. És important destacar que aquest és el primer informe de metilació induïda per iodoindol (un procés causat per l'acumulació de petits vacúols que es fusionen gradualment en vacúols gegants, que finalment condueixen a la ruptura de la membrana i la mort) en acícules de pi, amb el iodoindol que presenta propietats nematicides significatives similars a les del nematicida comercial avermectina.
Anteriorment s'ha informat que els indols exerceixen múltiples funcions de senyalització en procariotes i eucariotes, incloent-hi la inhibició/formació de biofilms, la supervivència bacteriana i la patogenicitat19,32,33,34. Recentment, els possibles efectes terapèutics dels indols halogenats, els alcaloides indolics i els derivats semisintètics de l'indol han atret un ampli interès per la recerca35,36,37. Per exemple, s'ha demostrat que els indols halogenats maten cèl·lules persistents d'Escherichia coli i Staphylococcus aureus37. A més, és d'interès científic estudiar l'eficàcia dels indols halogenats contra altres espècies, gèneres i regnes, i aquest estudi és un pas cap a la consecució d'aquest objectiu.
Aquí, proposem un mecanisme per a la letalitat induïda per 5-iodoindol en C. elegans basat en la lesió cel·lular reversible (RCI) i la metilació (figures 4C i 5). Els canvis edematosos com la inflor i la degeneració vacuolar són indicadors de RCI i metilació, manifestats com a vacúols gegants al citoplasma48,49. L'RCI interfereix amb la producció d'energia reduint la producció d'ATP, provocant una fallada de la bomba ATPasa o alterant les membranes cel·lulars i provocant una afluència ràpida de Na+, Ca2+ i aigua50,51,52. Els vacúols intracitoplasmàtics sorgeixen a les cèl·lules animals com a resultat de l'acumulació de líquid al citoplasma a causa de l'afluència de Ca2+ i aigua53. Curiosament, aquest mecanisme de dany cel·lular és reversible si el dany és temporal i les cèl·lules comencen a produir ATP durant un cert període de temps, però si el dany persisteix o empitjora, les cèl·lules moren.54 Les nostres observacions mostren que els nematodes tractats amb 5-iodoindol no són capaços de restaurar la biosíntesi normal després de l'exposició a condicions d'estrès.
El fenotip de metilació induït pel 5-iodoindol en B. xylophilus pot ser degut a la presència de iode i a la seva distribució molecular, ja que el 7-iodoindol va tenir menys efecte inhibidor sobre B. xylophilus que el 5-iodoindol (Taula 1 i Figura Suplementària S6). Aquests resultats són parcialment consistents amb els estudis de Maltese et al. (2014), que van informar que la translocació de la fracció de nitrogen piridil en l'indol des de la posició para a la meta abolia la vacuolització, la inhibició del creixement i la citotoxicitat en les cèl·lules U251, cosa que suggereix que la interacció de la molècula amb un lloc actiu específic a la proteïna és crítica27,44,45. Les interaccions entre l'indol o els indols halogenats i els receptors GluCL observades en aquest estudi també donen suport a aquesta noció, ja que es va trobar que el 5- i el 2-iodoindol s'uneixen als receptors GluCL amb més força que els altres indols examinats (Figura 6 i Figura Suplementària S8). Es va trobar que el iode a la segona o cinquena posició de l'indol s'uneix a la leucina 218 del receptor GluCL a través d'enllaços d'hidrogen de la cadena principal, mentre que altres indols halogenats i el mateix indol formen enllaços d'hidrogen de cadena lateral febles amb la serina 260 (Figura 6). Per tant, especulem que la localització de l'halogen juga un paper important en la inducció de la degeneració vacuolar, mentre que la forta unió del 5-iodoindol manté el canal iònic obert, permetent així una ràpida afluència de fluids i la ruptura del vacúol. Tanmateix, encara s'ha de determinar el mecanisme d'acció detallat del 5-iodoindol.
Abans de l'aplicació pràctica del 5-iodoindol, cal analitzar el seu efecte tòxic sobre les plantes. Els nostres experiments de germinació de llavors van mostrar que el 5-iodoindol no va tenir cap efecte negatiu sobre la germinació de les llavors ni sobre els processos de desenvolupament posteriors a les concentracions estudiades (Figura 7). Per tant, aquest estudi proporciona una base per a l'ús del 5-iodoindol en l'entorn ecològic per controlar la nocivitat dels nematodes del pin per als pins.
Informes anteriors han demostrat que la teràpia basada en indol representa un possible enfocament per abordar el problema de la resistència als antibiòtics i la progressió del càncer55. A més, els indols posseeixen activitats antibacterianes, anticancerígenes, antioxidants, antiinflamatòries, antidiabètiques, antivirals, antiproliferatives i antituberculoses i poden servir com a base prometedora per al desenvolupament de fàrmacs56,57. Aquest estudi suggereix per primera vegada l'ús potencial del iode com a agent antiparasitari i antihelmíntic.
L'avermectina es va descobrir fa tres dècades i va guanyar el Premi Nobel el 2015, i el seu ús com a antihelmíntic encara continua activament. Tanmateix, a causa del ràpid desenvolupament de la resistència a les avermectines en nematodes i plagues d'insectes, es necessita una estratègia alternativa, de baix cost i respectuosa amb el medi ambient per controlar la infecció per PWN en pins. Aquest estudi també informa del mecanisme pel qual el 5-iodoindol mata els nematodes del pin i que el 5-iodoindol té una baixa toxicitat per a les cèl·lules vegetals, cosa que obre bones perspectives per a la seva futura aplicació comercial.
Tots els experiments van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de la Universitat de Yeungnam, Gyeongsan, Corea, i els mètodes es van dur a terme d'acord amb les directrius del Comitè d'Ètica de la Universitat de Yeungnam.
Els experiments d'incubació d'ous es van dur a terme utilitzant procediments establerts43. Per avaluar les taxes d'eclosió (HR), es van transferir nematodes adults d'1 dia d'edat (aproximadament 100 femelles i 100 mascles) a plaques de Petri que contenien el fong i es van deixar créixer durant 24 h. A continuació, es van aïllar els ous i es van tractar amb 5-iodoindol (0,05 mM i 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) com a suspensió en aigua destil·lada estèril. Aquestes suspensions (500 μl; aproximadament 100 ous) es van transferir als pous d'una placa de cultiu de teixits de 24 pous i es van incubar a 22 °C. Els recomptes de L2 es van fer després de 24 h d'incubació, però es van considerar mortes si les cèl·lules no es movien quan s'estimulaven amb un filferro fi de platí. Aquest experiment es va dur a terme en dues etapes, cadascuna amb sis repeticions. Es van combinar i presentar les dades dels dos experiments. El percentatge de HR es calcula de la següent manera:
La mortalitat larvària es va avaluar mitjançant procediments desenvolupats prèviament. Es van recollir ous de nematodes i els embrions es van sincronitzar mitjançant l'eclosió en aigua destil·lada estèril per generar larves en estadi L2. Les larves sincronitzades (aproximadament 500 nematodes) es van tractar amb 5-iodoindol (0,05 mM i 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) i es van criar en plaques de Petri de B. cinerea. Després de 48 h d'incubació a 22 °C, es van recollir nematodes en aigua destil·lada estèril i es van examinar per detectar la presència d'estadis L2, L3 i L4. La presència d'estadis L3 i L4 indicava transformació larvària, mentre que la presència de l'estadi L2 no indicava cap transformació. Les imatges es van adquirir mitjançant el sistema d'imatges cel·lulars digitals iRiS™. Aquest experiment es va dur a terme en dues etapes, cadascuna amb sis repeticions. Es van combinar i presentar les dades d'ambdós experiments.
La toxicitat del 5-iodoindol i l'avermectina per a les llavors es va avaluar mitjançant proves de germinació en plaques d'agar Murashige i Skoog.62 Les llavors de *B. oleracea* i *R. raphanistrum* es van submergir primer en aigua destil·lada estèril durant un dia, es van rentar amb 1 ml d'etanol al 100%, es van esterilitzar amb 1 ml de lleixiu comercial al 50% (hipoclorit de sodi al 3%) durant 15 minuts i es van rentar cinc vegades amb 1 ml d'aigua estèril. A continuació, les llavors esterilitzades es van premsar sobre plaques d'agar de germinació que contenien 0,86 g/l (0,2X) de medi Murashige i Skoog i 0,7% d'agar bacteriològic amb o sense 5-iodoindol o avermectina. Les plaques es van incubar a 22 °C i es van prendre imatges després de 3 dies d'incubació. Aquest experiment es va dur a terme en dues etapes, cadascuna de les quals tenia sis repeticions.
Data de publicació: 26 de febrer de 2025