El nematode del pi és un endoparàsit migratori de quarantena conegut per causar greus pèrdues econòmiques als ecosistemes de la pineda. El present estudi revisa l'activitat nematicida dels indols halogenats contra els nematodes del pi i el seu mecanisme d'acció. Les activitats nematicides del 5-iodoindol i l'avermectina (control positiu) contra els nematodes del pi eren similars i elevades a concentracions baixes (10 μg/mL). El 5-iodoindol va reduir la fecunditat, l'activitat reproductiva, la mortalitat embrionària i larvària i el comportament locomotor. Les interaccions moleculars de lligands amb receptors de canal de clorur determinats per glutamat específics d'invertebrats donen suport a la idea que el 5-iodoindol, com l'avermectina, s'uneix fortament al lloc actiu del receptor. El 5-iodoindol també va induir diverses deformacions fenotípiques en nematodes, inclòs el col·lapse/contracció anormal d'òrgans i l'augment de la vacuolització. Aquests resultats suggereixen que els vacúols poden tenir un paper en la mort mediada per la metilació dels nematodes. És important destacar que el 5-iodoindol no era tòxic per a les dues espècies vegetals (col i rave). Així, aquest estudi demostra que l'aplicació de iodoindol en condicions ambientals pot controlar la lesió del marquit del pi.
El nematode de la fusta del pi (Bursaphelenchus xylophilus) pertany als nematodes de la fusta del pi (PWN), nematodes endoparàsits migratoris coneguts per causar danys ecològics greus als ecosistemes de la pineda1. La malaltia del marquit del pi (PWD) causada pel nematode de la fusta del pi s'està convertint en un problema greu en diversos continents, inclosos Àsia i Europa, i a Amèrica del Nord, el nematode destrueix les espècies de pi introduïdes1,2. El declivi dels pins és un problema econòmic important, i la perspectiva de la seva propagació global és preocupant3. Les espècies de pins següents són atacades amb més freqüència pel nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii i Pinus radiata4. El nematode del pi és una malaltia greu que pot matar els pins en setmanes o mesos després de la infecció. A més, els brots de nematodes del pi són freqüents en una varietat d'ecosistemes, de manera que s'han establert cadenes d'infecció persistents1.
Bursaphelenchus xylophilus és un nematode paràsit vegetal de quarantena que pertany a la superfamília Aphelenchoidea i al clade 102.5. El nematode s'alimenta de fongs i es reprodueix als teixits de la fusta dels pins, desenvolupant-se en quatre estadis larvaris diferents: L1, L2, L3, L4 i un individu adult1,6. En condicions d'escassetat d'aliments, el nematode del pi passa a una fase larvària especialitzada -dauer, que parasita el seu vector - l'escarabat de l'escorça del pi (Monochamus alternatus) i es trasllada a pins sans. En hostes sans, els nematodes migren ràpidament a través dels teixits vegetals i s'alimenten de cèl·lules parenquimatoses, la qual cosa provoca una sèrie de reaccions d'hipersensibilitat, marchitament del pi i mort en un any després de la infecció1,7,8.
El control biològic dels nematodes del pi ha estat durant molt de temps un repte, amb mesures de quarantena que es remunten al segle XX. Les estratègies actuals per controlar els nematodes del pi impliquen principalment tractaments químics, inclosa la fumigació de la fusta i la implantació de nematicides als troncs dels arbres. Els nematicides més utilitzats són l'avermectina i el benzoat d'avermectina, que pertanyen a la família de les avermectines. Aquests costosos productes químics són molt efectius contra moltes espècies de nematodes i es consideren segurs per al medi ambient9. No obstant això, s'espera que l'ús repetit d'aquests nematicides creï una pressió de selecció que gairebé segurament conduirà a l'aparició de nematodes resistents del pi, com s'ha demostrat per a diverses plagues d'insectes, com ara Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella i els nematodes Trichostrongylus colubylus i Ostertagia circumcincta, que han desenvolupat progressivament resistències a avermeriformis,12,11. Per tant, s'han d'estudiar regularment els patrons de resistència i examinar contínuament els nematicides per trobar mesures alternatives, rendibles i respectuoses amb el medi ambient per controlar la PVD. En les últimes dècades, diversos autors han proposat l'ús d'extractes vegetals, olis essencials i volàtils com a agents de control de nematodes13,14,15,16.
Recentment hem demostrat l'activitat nematicida de l'indol, una molècula de senyalització intercel·lular i interregne, a Caenorhabditis elegans 17 . L'indol és un senyal intracel·lular estès en l'ecologia microbiana, que controla nombroses funcions que afecten la fisiologia microbiana, la formació d'espores, l'estabilitat del plasmidi, la resistència als fàrmacs, la formació de biofilms i la virulència 18, 19 . No s'ha estudiat l'activitat de l'indol i els seus derivats contra altres nematodes patògens. En aquest estudi, vam investigar l'activitat nematicida de 34 índols contra nematodes del pi i vam dilucidar el mecanisme d'acció del 5-iodoindol més potent mitjançant microscòpia, fotografia de lapse de temps i experiments d'acoblament molecular, i vam avaluar els seus efectes tòxics sobre les plantes mitjançant un assaig de germinació de llavors.
S'ha informat anteriorment que concentracions elevades (> 1,0 mM) d'indol tenen un efecte nematicida sobre els nematodes17. Després del tractament de B. xylophilus (etapes de vida mixtes) amb indol o 33 derivats diferents d'indol a 1 mM, es va mesurar la mortalitat de B. xylophilus comptant nematodes vius i morts en els grups control i tractats. Cinc índols van mostrar una activitat nematicida significativa; la supervivència del grup control no tractat va ser del 95 ± 7% després de 24 h. Dels 34 indols provats, el 5-iodoindol i el 4-fluoroindol a 1 mM van causar una mortalitat del 100%, mentre que el 5,6-difluoroindigo, el metilindol-7-carboxilat i el 7-iodoindol van causar aproximadament un 50% de mortalitat (taula 1).
Efecte del 5-iodoindol sobre la formació de vacúols i el metabolisme del nematode de la fusta de pi. (A) Efecte de l'avermectina i el 5-iodoindol sobre els nematodes masculins adults, (B) ous de nematodes en fase L1 i (C) metabolisme de B. xylophilus, (i) no es van observar vacúols a les 0 h, el tractament va donar lloc a (ii) vacúols, (iii) acumulació de múltiples vacúols, (iv) vacuoles i vacuoles, (iv) vacuoles i vacuoles. (vi) formació de vacúols gegants. Les fletxes vermelles indiquen la inflamació de les vacúols, les fletxes blaves indiquen la fusió de les vacúols i les fletxes negres indiquen vacúols gegants. Barra d'escala = 50 μm.
A més, aquest estudi també va descriure el procés seqüencial de mort induïda per metà en nematodes del pi (figura 4C). La mort metanogènica és un tipus de mort cel·lular no apoptòtica associada a l'acumulació de vacúols citoplasmàtics prominents27. Els defectes morfològics observats en els nematodes del pi semblen estar estretament relacionats amb el mecanisme de la mort induïda pel metà. L'examen microscòpic en diferents moments va mostrar que es van formar vacúols gegants després de 20 h d'exposició a 5-iodoindol (0, 1 mM). Es van observar vacúols microscòpics després de 8 h de tractament i el seu nombre va augmentar després de 12 h. Es van observar diversos vacúols grans després de 14 h. Diversos vacúols fusionats eren clarament visibles després de 12-16 h de tractament, cosa que indica que la fusió de vacúols és la base del mecanisme de mort metanogènica. Després de 20 hores, es van trobar diversos vacúols gegants per tot el cuc. Aquestes observacions representen el primer informe de metuosi en C. elegans .
En els cucs tractats amb 5-iodoindol, també es va observar agregació i ruptura de vacúols (Fig. 5), com ho demostra la flexió dels cucs i l'alliberament de vacúols al medi ambient. També es va observar una disrupció de vacúols a la membrana de la closca de l'ou, que normalment es conserva intacta per L2 durant l'eclosió (Fig. suplementària S2). Aquestes observacions donen suport a la implicació de l'acumulació de líquids i la fallada osmoreguladora, així com la lesió cel·lular reversible (RCI), en el procés de formació i supuració de vacúols (Fig. 5).
Hipòtesant el paper del iode en la formació de vacúols observada, vam investigar l'activitat nematicida del iodur de sodi (NaI) i el iodur de potassi (KI). Tanmateix, a concentracions (0, 1, 0, 5 o 1 mM), no van afectar ni la supervivència dels nematodes ni la formació de vacúols (figura suplementària S5), tot i que 1 mM KI va tenir un lleuger efecte nematicida. D'altra banda, el 7-iodoindol (1 o 2 mM), com el 5-iodoindol, va induir múltiples vacúols i deformacions estructurals (figura suplementària S6). Els dos iodoindols van mostrar característiques fenotípiques similars en els nematodes del pi, mentre que NaI i KI no ho van fer. Curiosament, l'indol no va induir la formació de vacúols a B. xylophilus a les concentracions provades (dades no mostrades). Així, els resultats van confirmar que el complex indol-iode és responsable de la vacuolització i el metabolisme de B. xylophilus.
Entre els indols provats per a l'activitat nematicida, el 5-iodoindol va tenir l'índex de lliscament més alt de -5,89 kcal/mol, seguit del 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), el 4-fluoroindol (-4,33) i l'indol (-4,03) (Figura 6). El fort enllaç d'hidrogen de la columna vertebral del 5-iodoindol a la leucina 218 estabilitza la seva unió, mentre que tots els altres derivats d'indol s'uneixen a la serina 260 mitjançant enllaços d'hidrogen de cadena lateral. Entre altres iodoindols modelats, el 2-iodoindol té un valor d'unió de -5,248 kcal/mol, que es deu al seu principal enllaç d'hidrogen amb la leucina 218. Altres enllaços coneguts inclouen 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol) i kcal/mol. (Figura suplementària S8). La majoria d'indols halogenats i el propi indol, a excepció del 5-iodoindol i el 2-iodoindol, formen un enllaç amb la serina 260. El fet que l'enllaç d'hidrogen amb la leucina 218 sigui indicatiu d'una unió eficient receptor-lligand, tal com s'observa per a la ivermectina (figura suplementària S7 i 2-iodoidoi), confirma que això ho confirma. ivermectina, s'uneixen fortament al lloc actiu del receptor GluCL mitjançant la leucina 218 (Fig. 6 i Fig. S8 suplementària). Proposem que aquesta unió és necessària per mantenir l'estructura de porus oberts del complex GluCL i que, en unir-se fortament al lloc actiu del receptor GluCL, 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectina i ivermectina mantinguin el canal iònic obert i permetin la captació de líquids.
Acoblament molecular d'indol i indol halogenat a GluCL. Orientacions d'unió dels lligands (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol i (D) 5-iodoindol al lloc actiu de GluCL. La proteïna està representada per una cinta i els enllaços d'hidrogen de la columna vertebral es mostren com a línies de punts grocs. (A′), (B′), (C′) i (D′) mostren les interaccions dels lligands corresponents amb els residus d'aminoàcids circumdants, i els enllaços d'hidrogen de la cadena lateral s'indiquen amb fletxes de punts rosats.
Es van realitzar experiments per avaluar l'efecte tòxic del 5-iodoindol sobre la germinació de llavors de col i rave. El 5-iodoindol (0, 05 o 0, 1 mM) o l'avermectina (10 μg/mL) van tenir poc o cap efecte sobre la germinació inicial i l'emergència de les plantes (figura 7). A més, no es va trobar cap diferència significativa entre la taxa de germinació dels controls no tractats i les llavors tractades amb 5-iodoindol o avermectina. L'efecte sobre l'allargament de l'arrel pivotant i el nombre d'arrels laterals formades va ser insignificant, tot i que 1 mM (10 vegades la seva concentració activa) de 5-iodoindol va retardar lleugerament el desenvolupament de les arrels laterals. Aquests resultats indiquen que el 5-iodoindol no és tòxic per a les cèl·lules vegetals i no interfereix amb els processos de desenvolupament de les plantes a les concentracions estudiades.
Efecte del 5-iodoindol sobre la germinació de llavors. Germinació, brot i arrelament lateral de llavors de B. oleracea i R. raphanistrum en medi d'agar Murashige i Skoog amb o sense avermectina o 5-iodoindol. La germinació es va registrar després de 3 dies d'incubació a 22 °C.
Aquest estudi informa de diversos casos de mort de nematodes per indols. És important destacar que aquest és el primer informe de la metilació que indueix iodoindol (un procés causat per l'acumulació de petits vacúols que es fusionen gradualment en vacúols gegants, que finalment condueixen a la ruptura de la membrana i la mort) a les agulles de pi, amb iodoindol que presenta propietats nematicides significatives similars a les de l'avermectina nematicida comercial.
S'ha informat anteriorment que els indols exerceixen múltiples funcions de senyalització en procariotes i eucariotes, inclosa la inhibició/formació de biofilm, la supervivència bacteriana i la patogenicitat19,32,33,34. Recentment, els efectes terapèutics potencials d'indols halogenats, alcaloides indol i derivats d'indol semisintètics han atret un gran interès en la investigació35,36,37. Per exemple, s'ha demostrat que els índols halogenats maten les cèl·lules persistents d'Escherichia coli i Staphylococcus aureus37. A més, és d'interès científic estudiar l'eficàcia dels índols halogenats contra altres espècies, gèneres i regnes, i aquest estudi és un pas cap a la consecució d'aquest objectiu.
Aquí, proposem un mecanisme per a la letalitat induïda per 5-iodoindol a C. elegans basat en la lesió cel·lular reversible (RCI) i la metilació (figures 4C i 5). Els canvis edematosos com la inflor i la degeneració vacuolar són indicadors de RCI i metilació, que es manifesten com a vacúols gegants al citoplasma48,49. L'RCI interfereix amb la producció d'energia reduint la producció d'ATP, provocant una fallada de la bomba d'ATPasa o alterant les membranes cel·lulars i provocant una ràpida entrada de Na+, Ca2+ i aigua50,51,52. Els vacúols intracitoplasmàtics sorgeixen a les cèl·lules animals com a resultat de l'acumulació de líquid al citoplasma a causa de l'entrada de Ca2+ i aigua53. Curiosament, aquest mecanisme de dany cel·lular és reversible si el dany és temporal i les cèl·lules comencen a produir ATP durant un període de temps determinat, però si el dany persisteix o empitjora, les cèl·lules moren.54 Les nostres observacions mostren que els nematodes tractats amb 5-iodoindol són incapaços de restablir la biosíntesi normal després de l'exposició a condicions d'estrès.
El fenotip de metilació induït pel 5-iodoindol a B. xylophilus pot ser degut a la presència de iode i la seva distribució molecular, ja que el 7-iodoindol va tenir menys efecte inhibidor sobre B. xylophilus que el 5-iodoindol (taula 1 i figura suplementària S6). Aquests resultats són parcialment coherents amb els estudis de Maltese et al. (2014), que va informar que la translocació de la part de nitrogen piridil a l'indol de la posició para-a la meta va abolir la vacuolització, la inhibició del creixement i la citotoxicitat a les cèl·lules U251, cosa que suggereix que la interacció de la molècula amb un lloc actiu específic de la proteïna és crítica27,44,45. Les interaccions entre indol o indols halogenats i receptors GluCL observats en aquest estudi també donen suport a aquesta noció, ja que es va trobar que 5 i 2-iodoindol s'uneixen als receptors GluCL amb més força que els altres indols examinats (figura 6 i figura suplementària S8). Es va trobar que el iode a la segona o cinquena posició de l'indol s'uneix a la leucina 218 del receptor GluCL mitjançant enllaços d'hidrogen de la columna vertebral, mentre que altres indols halogenats i l'indol formen enllaços d'hidrogen de cadena lateral febles amb la serina 260 (figura 6). Per tant, especulem que la localització de l'halogen té un paper important en la inducció de la degeneració vacuolar, mentre que la unió estreta del 5-iodoindol manté obert el canal iònic, permetent així una ràpida afluència de fluids i la ruptura del vacúol. Tanmateix, el mecanisme d'acció detallat del 5-iodoindol encara està per determinar.
Abans de l'aplicació pràctica del 5-iodoindol, s'ha d'analitzar el seu efecte tòxic sobre les plantes. Els nostres experiments de germinació de llavors van demostrar que el 5-iodoindol no va tenir cap efecte negatiu sobre la germinació de llavors o els processos de desenvolupament posteriors a les concentracions estudiades (figura 7). Així, aquest estudi proporciona una base per a l'ús del 5-iodoindol en el medi ecològic per controlar la nocivitat dels nematodes del pi per als pins.
Informes anteriors han demostrat que la teràpia basada en indol representa un enfocament potencial per abordar el problema de la resistència als antibiòtics i la progressió del càncer55. A més, els índols posseeixen activitats antibacterianes, anticancerígenes, antioxidants, antiinflamatòries, antidiabètiques, antivirals, antiproliferatives i antituberculoses i poden servir com a base prometedora per al desenvolupament de fàrmacs56,57. Aquest estudi suggereix per primera vegada l'ús potencial del iode com a agent antiparasitari i antihelmíntic.
L'avermectina es va descobrir fa tres dècades i va guanyar el Premi Nobel el 2015, i el seu ús com a antihelmíntic encara continua activament. Tanmateix, a causa del ràpid desenvolupament de la resistència a les avermectines en nematodes i plagues d'insectes, es necessita una estratègia alternativa, de baix cost i respectuosa amb el medi ambient per controlar la infecció per PWN als pins. Aquest estudi també informa del mecanisme pel qual el 5-iodoindol mata els nematodes del pi i que el 5-iodoindol té una baixa toxicitat per a les cèl·lules vegetals, la qual cosa obre bones perspectives per a la seva futura aplicació comercial.
Tots els experiments van ser aprovats pel Comitè d'Ètica de la Universitat de Yeungnam, Gyeongsan, Corea, i els mètodes es van realitzar d'acord amb les directrius del Comitè d'Ètica de la Universitat de Yeungnam.
Els experiments d'incubació d'ous es van realitzar mitjançant procediments establerts43. Per avaluar les taxes d'eclosió (HR), es van transferir nematodes adults d'un dia d'edat (aproximadament 100 femelles i 100 mascles) a plaques de Petri que contenien el fong i es van deixar créixer durant 24 h. A continuació, es van aïllar els ous i es van tractar amb 5-iodoindol (0, 05 mM i 0, 1 mM) o avermectina (10 μg/ml) com a suspensió en aigua destil·lada estèril. Aquestes suspensions (500 μl; aproximadament 100 ous) es van transferir als pous d'una placa de cultiu de teixits de 24 pous i es van incubar a 22 ° C. Els recomptes de L2 es van fer després de 24 h d'incubació, però es van considerar mortes si les cèl·lules no es mouen quan es van estimular amb un fil de platí fi. Aquest experiment es va dur a terme en dues etapes, cadascuna amb sis repeticions. Es van combinar i presentar les dades dels dos experiments. El percentatge de recursos humans es calcula de la següent manera:
La mortalitat de larva es va avaluar mitjançant procediments desenvolupats prèviament. Es van recollir ous de nematodes i es van sincronitzar els embrions mitjançant l'eclosió en aigua destil·lada estèril per generar larves en fase L2. Les larves sincronitzades (uns 500 nematodes) es van tractar amb 5-iodoindol (0,05 mM i 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) i es van criar en plaques de B. cinerea Petri. Després de 48 h d'incubació a 22 ° C, es van recollir nematodes en aigua destil·lada estèril i es van examinar la presència de les etapes L2, L3 i L4. La presència de les etapes L3 i L4 indicava transformació larvària, mentre que la presència de l'etapa L2 no indicava cap transformació. Les imatges es van adquirir mitjançant el sistema d'imatge de cèl·lules digitals iRiS ™. Aquest experiment es va dur a terme en dues etapes, cadascuna amb sis repeticions. Es van combinar i presentar les dades dels dos experiments.
La toxicitat del 5-iodoindol i l'avermectina per a les llavors es va avaluar mitjançant proves de germinació en plaques d'agar Murashige i Skoog. hipoclorit) durant 15 min, i es renta cinc vegades amb 1 ml d'aigua estèril. A continuació, les llavors esterilitzades es van pressionar sobre plaques d'agar de germinació que contenien 0,86 g/l (0,2X) de medi Murashige i Skoog i 0,7% d'agar bacteriològic amb o sense 5-iodoindol o avermectina. A continuació, es van incubar les plaques a 22 ° C i es van prendre imatges després de 3 dies d'incubació. Aquest experiment es va dur a terme en dues etapes, cadascuna de les quals va tenir sis repeticions.
Hora de publicació: 26-feb-2025