Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per obtenir els millors resultats, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del vostre navegador (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
El descobriment i l'ús beneficiós de productes naturals poden ajudar a millorar la vida humana. Els productes químics inhibidors del creixement de les plantes s'utilitzen àmpliament com a herbicides per controlar les males herbes. A causa de la necessitat d'utilitzar diferents tipus d'herbicides, cal identificar compostos amb nous mecanismes d'acció. En aquest estudi, vam descobrir un nou compost N-alcoxipirrol, la cumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 i vam establir el procés de síntesi complet. Mitjançant assaigs d'activitat biològica, vam descobrir que l'àcid urs-monoàmic és un intermediari sintètic de l'urs-monoamida i un potencial...inhibidor del creixement de les plantesA més, hem desenvolupat diversos derivats de l'àcid urbenònic, inclòs el derivat urbeniloxi (UDA), que té una alta activitat herbicida sense afectar negativament el creixement de les cèl·lules HeLa. També hem descobert que els derivats de l'àcid urmotònic interrompen els microtúbuls de les plantes; a més, el KAND afecta els filaments d'actina i indueix la mort cel·lular; aquests efectes multifacètics difereixen dels dels inhibidors de microtúbuls coneguts i suggereixen un nou mecanisme d'acció per a l'àcid ursònic, que representa un avantatge important en el desenvolupament de nous herbicides.
El descobriment i l'aplicació pràctica de productes naturals beneficiosos i els seus derivats és un mitjà per millorar la qualitat de vida humana. Els metabòlits secundaris produïts per microorganismes, plantes i insectes han conduït a importants avenços en medicina i agricultura. S'han desenvolupat molts antibiòtics i fàrmacs antileucèmics a partir de productes naturals. A més, diversos tipus depesticides, els fungicides i els herbicides s'extreuen d'aquests productes naturals per al seu ús en l'agricultura. En particular, els herbicides per al control de males herbes són eines importants per augmentar el rendiment dels cultius en l'agricultura moderna, i ja s'utilitzen comercialment diversos tipus de compostos. Diversos processos cel·lulars en les plantes, com la fotosíntesi, el metabolisme dels aminoàcids, la síntesi de la paret cel·lular, la regulació de la mitosi, la senyalització de fitohormones o la síntesi de proteïnes, es consideren objectius típics dels herbicides. Els compostos que inhibeixen la funció dels microtúbuls són una classe comuna d'herbicides que afecten el creixement de les plantes afectant la regulació mitòtica2.
Els microtúbuls són components del citoesquelet i estan àmpliament conservats en cèl·lules eucariotes. L'heterodímer de tubulina consisteix en α-tubulina i β-tubulina que formen protofilaments lineals de microtúbuls, amb 13 protofilaments que formen una estructura cilíndrica. Els microtúbuls tenen múltiples funcions en les cèl·lules vegetals, com ara determinar la forma cel·lular, la divisió cel·lular i el transport intracel·lular3,4. Les cèl·lules vegetals contenen microtúbuls sota la membrana plasmàtica en interfase, i es creu que aquests anomenats microtúbuls corticals controlen l'organització de les microfibril·les de cel·lulosa mitjançant la regulació dels complexos de cel·lulosa sintasa4,5. Els microtúbuls corticals de les cèl·lules epidèrmiques de l'arrel, presents a la zona d'elongació ràpida de la punta de l'arrel, es troben lateralment, i les microfibres de cel·lulosa segueixen aquests microtúbuls i limiten la direcció de l'expansió cel·lular, promovent així l'elongació cel·lular anisotròpica. Per tant, la funció dels microtúbuls està estretament relacionada amb la morfologia de la planta. Les substitucions d'aminoàcids en gens que codifiquen la tubulina causen una distorsió de les matrius de microtúbuls corticals i un creixement cap a l'esquerra o la dreta a Arabidopsis 6,7. De la mateixa manera, les mutacions en les proteïnes associades als microtúbuls que regulen la dinàmica dels microtúbuls també poden conduir a un creixement distorsionat de les arrels8,9,10,11,12,13. A més, el tractament amb herbicides que alteren els microtúbuls com la disopiramida, també coneguda com a pretilaclor, també provoca un creixement oblic de les arrels cap a l'esquerra14. Aquestes dades indiquen que la regulació precisa de la funció dels microtúbuls és fonamental per determinar la direcció del creixement de les plantes.
S'han descobert diversos tipus d'inhibidors de microtúbuls, i aquests fàrmacs han fet contribucions significatives a la investigació del citoesquelet, així com a l'agricultura i la medicina2. En particular, l'orizalina, els compostos de dinitroanilina, la disopiramida, els compostos relacionats amb la benzamida i els seus anàlegs poden inhibir la funció dels microtúbuls i, per tant, inhibir el creixement de les plantes. Per tant, s'utilitzen àmpliament com a herbicides. Tanmateix, atès que els microtúbuls són un component important de les cèl·lules vegetals i animals, la majoria dels inhibidors de microtúbuls són citotòxics per a tots dos tipus de cèl·lules. Per tant, malgrat la seva utilitat reconeguda com a herbicides, s'utilitza un nombre limitat d'agents antimicrotúbuls amb finalitats pràctiques.
Streptomyces és un gènere de la família Streptomyces, que inclou bacteris filamentosos aeròbics, grampositius i és àmpliament conegut per la seva capacitat de produir una àmplia gamma de metabòlits secundaris. Per tant, es considera una de les fonts més importants de nous productes naturals biològicament actius. En l'estudi actual, hem descobert un nou compost anomenat cumamonamida, que es va aïllar de Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Mitjançant anàlisi espectral i anàlisi espectral completa, es va caracteritzar l'estructura de la cumamonamida i es va determinar el seu esquelet únic de N-alcoxipirrol. síntesi. Es va trobar que l'àcid ursmònic, un intermediari sintètic de la ursmonoamida i els seus derivats, inhibeix el creixement i la germinació de la popular planta model Arabidopsis thaliana. En un estudi de relació estructura-activitat, vam trobar que un compost amb C9 modificat a àcid ursònic, anomenat derivat noniloxi de l'àcid ursònic (KAND), millora significativament l'efecte inhibidor sobre el creixement i la germinació. Cal destacar que l'inhibidor del creixement de les plantes recentment descobert també va afectar el creixement del tabac i l'hepàtica, i no va ser citotòxic per als bacteris ni les cèl·lules HeLa. A més, alguns derivats de l'àcid urmotònic indueixen un fenotip d'arrel distorsionat, cosa que implica que aquests derivats afecten directament o indirectament els microtúbuls. D'acord amb aquesta idea, les nostres observacions de microtúbuls marcats immunohistoquímicament o amb proteïnes fluorescents indiquen que el tractament KAND despolimeritza els microtúbuls. A més, el tractament amb derivats de l'àcid kumamotonic va interrompre els microfilaments d'actina. Així, hem descobert un nou inhibidor del creixement de les plantes, el mecanisme d'acció únic del qual implica la destrucció del citoesquelet.
La soca MK493-CF1 es va aïllar del sòl a Shinagawa-ku, Tòquio. La soca MK493-CF1 formava un miceli estromal ben ramificat. Es va determinar la seqüència parcial del gen de l'ARN ribosòmic 16S (1422 pb). Aquesta soca és molt similar a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: soca típica, 99,93%). Basant-nos en aquest resultat, es va determinar que aquesta soca estava estretament relacionada amb la soca tipus de S. werraensis. Per tant, vam anomenar provisionalment aquesta soca S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T també produeix els mateixos compostos bioactius. Com que hi va haver poca investigació inicial sobre l'obtenció de productes naturals d'aquest microorganisme, es va dur a terme més investigació química. Després del cultiu de S. werraensis MK493-CF1 en medi d'ordi mitjançant fermentació en estat sòlid a 30 °C durant 14 dies, el medi es va extreure amb un 50% d'EtOH. Es van assecar 60 ml de mostra per obtenir 59,5 mg d'extracte cru. L'extracte cru es va sotmetre a HPLC de fase inversa per donar N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, anomenada cumamonamida, 36,0 mg). La quantitat total d'1 és aproximadament el 60% de l'extracte cru. Per tant, vam decidir estudiar en detall les propietats de la kumamotoamida 1.
La cumamonamida 1 és una pols amorfa blanca i l'espectrometria de masses d'alta resolució (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1). El fragment de pirrol substituït per C2 d'aquest compost es caracteritza per δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH en l'espectre de RMN 1H: 4,5 Hz, H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), i l'espectre de RMN 13C mostra la presència de quatre àtoms de carboni sp2. La presència d'un grup amida a la posició C2 es va avaluar mitjançant la correlació HMBC des del protó C-3 fins al carboni carbonil amida a δC 161,1. A més, els pics de RMN 1H i 13C a δH 4.10 (3H, S) i δC 68.3 indiquen la presència de grups N-metoxi a la molècula. Tot i que la posició correcta del grup metoxi encara no s'havia determinat mitjançant anàlisis espectroscòpiques com ara l'espectroscòpia de diferència millorada i l'abreviatura nuclear d'Overhauser (NOEDF), la N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida es va convertir en el primer compost candidat.
Per determinar l'estructura correcta d'1, es va realitzar una síntesi total (Fig. 2a). El tractament de la 2-aminopiridina 2 disponible comercialment amb m-CPBA va donar lloc al N-òxid 3 corresponent amb un rendiment quantitatiu. Després de la 2-aminoazidació de 2, es va dur a terme la reacció de ciclocondensació descrita per Abramovich en benzè a 90 °C per obtenir l'1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitril 5 desitjat en grams. Velocitat 60% (dues etapes). 15,16. La metilació i hidròlisi de 4 va donar llavors àcid 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílic (anomenat "àcid cumotònic", 6) amb un bon rendiment (70%, dues etapes). Finalment, l'amidació mitjançant l'intermedi de clorur d'àcid 6 utilitzant amoníac aquós va donar l'amida de Kumamoto 1 amb un rendiment del 98%. Totes les dades espectrals de l'1 sintetitzat eren similars a les de l'1 aïllat, per la qual cosa es va determinar l'estructura d'1;
Síntesi general i anàlisi de l'activitat biològica de l'urbenamida i l'àcid urbènic. (a) Síntesi total d'amida de Kumamoto. (b) Plàntules d'Arabidopsis Columbia (Col) de tipus salvatge de set dies d'edat es van cultivar en plaques de Murashige i Skoog (MS) que contenien cumamonamida 6 o cumamonamida 1 a les concentracions indicades. Barra d'escala = 1 cm.
Primer, vam avaluar les activitats biològiques de l'urbenamida i els seus intermediaris per la seva capacitat per modular el creixement de les plantes. Vam afegir diverses concentracions d'ursmonamida 1 o àcid ursònic 6 al medi d'agar MS i vam cultivar plàntules d'Arabidopsis thaliana en aquest medi. Aquests assaigs van mostrar que altes concentracions (500 μM) de 6 inhibien el creixement de les arrels (Fig. 2b). A continuació, vam generar diversos derivats substituint la posició N1 de 6 i vam realitzar estudis de relació estructura-activitat sobre ells (el procés de síntesi analògica es descriu a la Informació complementària (SI)). Les plàntules d'Arabidopsis es van cultivar en un medi que contenia 50 μM de derivats de l'àcid ursònic i es va mesurar la longitud de l'arrel, tal com es mostra a la imatge. Com es mostra a les figures 3a, b i S1, els cumamoàcids tenen diferents longituds de cadenes alcoxi lineals (9, 10, 11, 12 i 13) o cadenes alcoxi grans (15, 16 i 17) a la posició N1. Els derivats van mostrar una inhibició significativa del creixement de les arrels. A més, vam trobar que l'aplicació de 200 μM de 10, 11 o 17 inhibia la germinació (Figs. 3c i S2).
Estudi de la relació estructura-activitat de l'amida de Kumamoto i compostos relacionats. (a) Estructura i esquema de síntesi dels anàlegs. (b) Quantificació de la longitud de l'arrel de plàntules de 7 dies cultivades en medi MS amb o sense derivats de cumamonamida de 50 μM. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (prova t, p< 0,05). n>18. Les dades es mostren com a mitjana ± SD. nt significa "no provat" perquè més del 50% de les llavors no van germinar. (c) Quantificació de la taxa de germinació de les llavors tractades incubades durant 7 dies en medi MS amb o sense 200 μM de cumamonamida i compostos relacionats. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (prova de khi quadrat). n = 96.
Curiosament, l'addició de cadenes laterals d'alquil més llargues que C9 va reduir l'activitat inhibidora, cosa que suggereix que els compostos relacionats amb l'àcid kumamotoic requereixen cadenes laterals d'una certa mida per exhibir la seva activitat biològica.
Com que l'anàlisi de la relació estructura-activitat va mostrar que C9 es va modificar a àcid ursònic i que el derivat noniloxi de l'àcid ursònic (d'ara endavant anomenat KAND 11) era l'inhibidor del creixement de les plantes més eficaç, vam dur a terme una caracterització més detallada de KAND 11. El tractament d'Arabidopsis amb 50 μM de KAND 11 va impedir gairebé completament la germinació, mentre que concentracions més baixes (40, 30, 20 o 10 μM) de KAND 11 van inhibir el creixement de les arrels de manera dependent de la dosi (Fig. 4a, b). Per comprovar si KAND 11 afecta la viabilitat del meristema radicular, vam examinar els meristemes radiculars tenyits amb iodur de propidi (PI) i vam mesurar la mida de l'àrea del meristema. La mida del meristem de les plàntules cultivades en un medi que contenia 25 μM de KAND-11 va ser de 151,1 ± 32,5 μm, mentre que la mida del meristem de les plàntules cultivades en un medi de control que contenia DMSO va ser de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), cosa que indica que KAND-11 restaura l'activitat cel·lular. propagació. Meristem radicular. D'acord amb això, el tractament amb KAND 11 va reduir la quantitat del senyal del marcador de divisió cel·lular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS al meristem radicular (Fig. 4e) 17. Aquests resultats indiquen que KAND 11 inhibeix el creixement de les arrels reduint l'activitat de proliferació cel·lular.
Anàlisi de l'efecte inhibidor dels derivats de l'àcid urbenònic (derivats d'urbeniloxi) sobre el creixement. (a) Plàntules de Col de tipus salvatge de 7 dies d'edat cultivades en plaques de MS amb les concentracions indicades de KAND 11. Barra d'escala = 1 cm. (b) Quantificació de la longitud de l'arrel. Les lletres indiquen diferències significatives (prova de Tukey HSD, p< 0,05). n>16. Les dades es mostren com a mitjana ± SD. (c) Microscòpia confocal d'arrels de Col de tipus salvatge tenyides amb iodur de propidi cultivades en plaques de MS amb o sense KAND 11 de 25 μM. Els claudàtors blancs indiquen el meristema radicular. Barra d'escala = 100 µm. (d) Quantificació de la mida del meristema radicular (n = 10 a 11). Les diferències estadístiques es van determinar mitjançant la prova t (p< 0,05). Les barres representen la mida mitjana del meristema. (e) Microscòpia de contrast d'interferència diferencial (DIC) d'un meristema d'arrel que conté la construcció CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS tenyit i tenyit en plàntules de 5 dies cultivades en plaques de MS amb o sense assaig KAND de 25 µM.
La fitotoxicitat de KAND 11 es va provar més a fons utilitzant una altra planta dicotiledònia, el tabac (Nicotiana tabacum), i un important organisme model de planta terrestre, l'hepàtica (Marchantia polymorpha). Com en el cas d'Arabidopsis, les plàntules de tabac SR-1 cultivades en un medi que contenia 25 μM de KAND 11 van produir arrels més curtes (Fig. 5a). A més, 40 de les 48 llavors van germinar en plaques que contenien 200 μM de KAND 11, mentre que les 48 llavors van germinar en medis tractats amb fàrmacs, cosa que indica que concentracions més altes de KAND eren significatives (p< 0,05; prova de khi quadrat) va inhibir la germinació del tabac. (Fig. 5b). A més, la concentració de KAND 11 que inhibia el creixement bacterià en l'hepàtica era similar a la concentració efectiva en Arabidopsis (Fig. 5c). Aquests resultats indiquen que KAND 11 pot inhibir el creixement d'una varietat de plantes. A continuació, vam investigar la possible citotoxicitat dels compostos relacionats amb la monoamida d'ós en altres organismes, és a dir, cèl·lules HeLa humanes i la soca DH5α d'Escherichia coli, com a representants de cèl·lules animals superiors i bacterianes, respectivament. En una sèrie d'assajos de proliferació cel·lular, vam observar que la cumamonamida 1, l'àcid cumamonadídic 6 i KAND 11 no afectaven el creixement de cèl·lules HeLa o E. coli a concentracions de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibició del creixement de KAND 11 en organismes que no són Arabidopsis. (a) Plàntules de tabac SR-1 de tipus salvatge de dues setmanes es van cultivar en plaques de MS col·locades verticalment que contenien 25 μM de KAND 11. (b) Plàntules de tabac SR-1 de tipus salvatge de dues setmanes es van cultivar en plaques de MS col·locades horitzontalment que contenien 200 μM de KAND 11. (c) Brots d'hepàtica Tak-1 de tipus salvatge de dues setmanes cultivats en plaques Gamborg B5 amb les concentracions indicades de KAND 11. Les fletxes vermelles indiquen les espores que van deixar de créixer durant el període d'incubació de dues setmanes. (d) Assaig de proliferació cel·lular de cèl·lules HeLa. El nombre de cèl·lules viables es va mesurar a intervals de temps fixos utilitzant un kit de recompte cel·lular 8 (Dojindo). Com a control, les cèl·lules HeLa es van tractar amb 5 μg/ml d'actinomicina D (Act D), que inhibeix la transcripció de l'ARN polimerasa i causa la mort cel·lular. Les anàlisis es van realitzar per triplicat. (e) Assaig de proliferació cel·lular d'E. coli. El creixement d'E. coli es va analitzar mesurant la DO600. Com a control, les cèl·lules es van tractar amb 50 μg/ml d'ampicil·lina (Amp), que inhibeix la síntesi de la paret cel·lular bacteriana. Les anàlisis es van realitzar per triplicat.
Per desxifrar el mecanisme d'acció de la citotoxicitat causada pels compostos relacionats amb la uramida, vam reanalitzar derivats de l'àcid urbènic amb efectes inhibidors moderats, tal com es mostra a la imatge. Com es mostra a les figures 2b, 6a, les plàntules cultivades en plaques d'agar que contenien altes concentracions (200 μM) d'àcid urmotònic 6 van produir arrels més curtes i corbes cap a l'esquerra (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre que les plàntules cultivades en el medi de control van produir arrels gairebé rectes (θ = – 3,8 ± 7,1). Se sap que aquest creixement oblic característic és el resultat de la disfunció dels microtúbuls corticals14,18. D'acord amb aquesta troballa, els fàrmacs desestabilitzadors dels microtúbuls, la disopiramida i l'orizalina, van induir una inclinació similar de les arrels en les nostres condicions de creixement (figures 2b, 6a). Al mateix temps, vam provar derivats de l'àcid urmotònic i en vam seleccionar diversos que, a certes concentracions, induïen el creixement oblic de les arrels. Els compostos 8, 9 i 15 van canviar la direcció del creixement de les arrels a 75 μM, 50 μM i 40 μM, respectivament, cosa que indica que aquests compostos poden desestabilitzar eficaçment els microtúbuls (Fig. 2b, 6a). També vam provar el derivat d'àcid ursòlic més potent, KAND 11, a una concentració més baixa (15 µM) i vam descobrir que l'aplicació de KAND 11 inhibia el creixement de les arrels i que la direcció del creixement de les arrels era desigual, tot i que tendien a inclinar-se cap a l'esquerra (Figura C3). Com que concentracions més altes de fàrmacs desestabilitzadors dels microtúbuls de vegades inhibeixen el creixement de les plantes en lloc de causar la inclinació de les arrels, posteriorment vam avaluar la possibilitat que KAND 11 afecti els microtúbuls observant els microtúbuls corticals a les cèl·lules epidèrmiques de les arrels. La immunohistoquímica utilitzant anticossos anti-β-tubulina en cèl·lules epidèrmiques d'arrels de plàntules tractades amb 25 μM de KAND 11 va mostrar la desaparició de gairebé tots els microtúbuls corticals a les cèl·lules epidèrmiques de la zona d'elongació (Fig. 6b). Aquests resultats indiquen que l'àcid kumamotonic i els seus derivats actuen directament o indirectament sobre els microtúbuls per interrompre'ls i que aquests compostos són nous inhibidors dels microtúbuls.
L'àcid ursònic i els seus derivats alteren els microtúbuls corticals d'Arabidopsis thaliana. (a) Angle d'inclinació de l'arrel mesurat en presència de diversos derivats de l'àcid urmotònic a les concentracions indicades. També es van analitzar els efectes de dos compostos que se sap que inhibeixen els microtúbuls: la disopiramida i l'orizalina. El requadre mostra l'estàndard utilitzat per mesurar l'angle de creixement de l'arrel. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (prova t, p< 0,05). n>19. Barra d'escala = 1 cm. (b) Microtúbuls corticals en cèl·lules epidèrmiques a la zona d'elongació. Els microtúbuls en arrels d'Arabidopsis Col de tipus salvatge cultivades en plaques de MS amb o sense KAND 11 de 25 μM es van visualitzar mitjançant tinció immunohistoquímica utilitzant anticossos primaris de β-tubulina i anticossos secundaris conjugats amb Alexa Fluor. Barra d'escala = 10 µm. (c) Estructura mitòtica dels microtúbuls en el meristem de l'arrel. Els microtúbuls es van visualitzar mitjançant tinció immunohistoquímica. Les estructures mitòtiques, incloses les zones de profase, els fusos i els fragmoplasts, es van comptar a partir d'imatges confocals. Les fletxes indiquen estructures de microtúbuls mitòtics. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (prova t, p< 0,05). n>9. Barra d'escala = 50 µm.
Tot i que Ursa té la capacitat d'interrompre la funció dels microtúbuls, s'espera que el seu mecanisme d'acció sigui diferent dels agents despolimeritzadors de microtúbuls típics. Per exemple, concentracions més altes d'agents despolimeritzadors de microtúbuls com la disopiramida i l'orizalina indueixen l'expansió anisotròpica de les cèl·lules epidèrmiques, mentre que KAND 11 no ho fa. A més, la coaplicació de KAND 11 i disopiramida va donar lloc a una resposta combinada de creixement d'arrels induïda per disopiramida i es va observar una inhibició del creixement induïda per KAND 11 (Fig. S4). També vam analitzar la resposta del mutant hipersensible disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 té una mutació puntual de tubulina quinasa no canònica i produeix arrels més curtes quan es tracta amb disopiramida9,20. Les plàntules mutants phs1-1 cultivades en medi d'agar que conté KAND 11 tenien arrels més curtes similars a les cultivades en disopiramida (fig. S5).
A més, vam observar estructures de microtúbuls mitòtics, com ara zones de profase, fusos i fragmoplasts, al meristem radicular de les plàntules tractades amb KAND 11. D'acord amb les observacions per a CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, es va observar una disminució significativa en el nombre de microtúbuls mitòtics (Fig. .6c).
Per caracteritzar la citotoxicitat de KAND 11 a resolució subcel·lular, vam tractar cèl·lules en suspensió BY-2 de tabac amb KAND 11 i vam observar la seva resposta. Primer vam afegir KAND 11 a cèl·lules BY-2 que expressaven TagRFP-TUA6, que marca fluorescentment els microtúbuls, per avaluar l'efecte de KAND 11 sobre els microtúbuls corticals. La densitat de microtúbuls corticals es va avaluar mitjançant l'anàlisi d'imatges, que va quantificar el percentatge de píxels del citoesquelet entre els píxels citoplasmàtics. Els resultats de l'assaig van mostrar que després del tractament amb 50 μM o 100 μM de KAND 11 durant 1 hora, la densitat va disminuir significativament fins al 0,94 ± 0,74% o 0,23 ± 0,28%, respectivament, mentre que la densitat de cèl·lules tractades amb DMSO va ascendir a 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Aquests resultats són consistents amb l'observació a Arabidopsis que el tractament amb KAND 11 indueix la despolimerització dels microtúbuls corticals (Fig. 6b). També vam examinar la línia BY-2 amb filaments d'actina marcats amb GFP-ABD després del tractament amb la mateixa concentració de KAND 11 i vam observar que el tractament amb KAND 11 va interrompre els filaments d'actina. El tractament amb 50 μM o 100 μM de KAND 11 durant 1 h va reduir significativament la densitat dels filaments d'actina a 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, respectivament, mentre que la densitat en cèl·lules tractades amb DMSO va ser d'1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Aquests resultats contrasten amb els efectes de la propizamida, que no afecta els filaments d'actina, i la latrunculina B, un despolimeritzador d'actina que no afecta els microtúbuls (Figura S6 del SI). A més, el tractament amb cumamonamida 1, àcid cumamonamida 6 o KAND 11 no va afectar els microtúbuls en cèl·lules HeLa (Figura S7 del SI). Així doncs, es creu que el mecanisme d'acció de KAND 11 és diferent del dels disruptors del citoesquelet coneguts. A més, la nostra observació microscòpica de cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 va revelar l'aparició de la mort cel·lular durant el tractament amb KAND 11 i va mostrar que la proporció de cèl·lules mortes tenyides amb blau Evans no va augmentar significativament després de 30 minuts de tractament amb KAND 11, mentre que després de 90 minuts de tractament amb KAND 50 μM o 100 μM, el nombre de cèl·lules mortes va augmentar fins al 43,7% o el 80,1%, respectivament (Fig. 7c). En conjunt, aquestes dades indiquen que el nou derivat d'àcid ursòlic KAND 11 és un inhibidor del citoesquelet específic de plantes amb un mecanisme d'acció prèviament desconegut.
El KAND afecta els microtúbuls corticals, els filaments d'actina i la viabilitat de les cèl·lules BY-2 del tabac. (a) Visualització dels microtúbuls corticals en cèl·lules BY-2 en presència de TagRFP-TUA6. Les cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO es van examinar mitjançant microscòpia confocal. La densitat dels microtúbuls corticals es va calcular a partir de micrografies de 25 cèl·lules independents. Les lletres indiquen diferències significatives (prova de Tukey HSD, p< 0,05). Barra d'escala = 10 µm. (b) Filaments d'actina cortical en cèl·lules BY-2 visualitzades en presència de GFP-ABD2. Les cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO es van examinar mitjançant microscòpia confocal. La densitat dels filaments d'actina cortical es va calcular a partir de micrografies de 25 cèl·lules independents. Les lletres indiquen diferències significatives (prova de Tukey HSD, p< 0,05). Barra d'escala = 10 µm. (c) Observació de cèl·lules BY-2 mortes mitjançant tinció amb blau Evans. Les cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO es van examinar mitjançant microscòpia de camp clar. n = 3. Barra d'escala = 100 µm.
El descobriment i l'aplicació de nous productes naturals ha conduït a avenços significatius en diversos aspectes de la vida humana, incloent-hi la medicina i l'agricultura. S'han dut a terme investigacions històriques per obtenir compostos útils a partir de recursos naturals. En particular, se sap que els actinomicets són útils com a antibiòtics antiparasitaris per als nematodes a causa de la seva capacitat de produir diversos metabòlits secundaris com l'avermectina, el compost principal de la ivermectina i la bleomicina i els seus derivats, utilitzats medicinalment com a agent anticancerígen21,22. Així mateix, s'ha descobert una varietat de compostos herbicides a partir d'actinomicets, alguns dels quals ja s'utilitzen comercialment1,23. Per tant, l'anàlisi dels metabòlits dels actinomicets per aïllar productes naturals amb activitats biològiques desitjades es considera una estratègia eficaç. En aquest estudi, hem descobert un nou compost, la cumamonamida, de S. werraensis i l'hem sintetitzat amb èxit. L'àcid ursònic és un intermediari sintètic de l'urbenamida i els seus derivats. Pot causar un enrotllament característic de les arrels, presentar una activitat herbicida moderada a forta i danyar directament o indirectament els microtúbuls de les plantes. Tanmateix, el mecanisme d'acció de l'àcid urmotònic pot diferir del dels inhibidors de microtúbuls existents, ja que el KAND 11 també altera els filaments d'actina i provoca la mort cel·lular, cosa que suggereix un mecanisme regulador pel qual l'àcid urmotònic i els seus derivats influeixen en una àmplia gamma d'estructures del citoesquelet.
Una caracterització més detallada de l'àcid urbenònic ajudarà a comprendre millor el mecanisme d'acció de l'àcid urbenònic. En particular, el següent objectiu és avaluar la capacitat de l'àcid ursònic per unir-se a microtúbuls reduïts per determinar si l'àcid ursònic i els seus derivats actuen directament sobre els microtúbuls i els despolimeritzen, o si la seva acció provoca la desestabilització dels microtúbuls. A més, en el cas que els microtúbuls no siguin un objectiu directe, identificar el lloc d'acció i les dianes moleculars de l'àcid ursònic a les cèl·lules vegetals ajudarà a comprendre millor les propietats dels compostos relacionats i les possibles maneres de millorar l'activitat herbicida. El nostre assaig de bioactivitat va revelar la capacitat citotòxica única de l'àcid ursònic sobre el creixement de plantes com l'Arabidopsis thaliana, el tabac i l'hepàtica, mentre que ni les cèl·lules E. coli ni les HeLa es van veure afectades. La poca o cap toxicitat per a les cèl·lules animals és un avantatge dels derivats de l'àcid ursònic si es desenvolupen com a herbicides per al seu ús en camps agrícoles oberts. De fet, com que els microtúbuls són estructures comunes en els eucariotes, la seva inhibició selectiva en les plantes és un requisit clau per als herbicides. Per exemple, la propizamida, un agent despolimeritzant de microtúbuls que s'uneix directament a la tubulina i inhibeix la polimerització, s'utilitza com a herbicida a causa de la seva baixa toxicitat per a les cèl·lules animals24. A diferència de la disopiramida, les benzamides relacionades tenen especificitats diana diferents. A més dels microtúbuls vegetals, l'RH-4032 o la benzoxamida també inhibeixen els microtúbuls de les cèl·lules animals o oomicets, respectivament, i la zalilamida s'utilitza com a fungicida a causa de la seva baixa fitotoxicitat25,26,27. L'ós recentment descobert i els seus derivats presenten citotoxicitat selectiva contra les plantes, però val la pena assenyalar que modificacions posteriors poden alterar la seva especificitat diana, proporcionant potencialment derivats addicionals per al control de fongs patògens o oomicets.
Les propietats úniques de l'àcid urbenònic i els seus derivats són útils per al seu desenvolupament com a herbicides i ús com a eines de recerca. La importància del citoesquelet en el control de la forma de les cèl·lules vegetals és àmpliament reconeguda. Estudis anteriors han demostrat que les plantes han desenvolupat mecanismes complexos d'organització dels microtúbuls corticals controlant la dinàmica dels microtúbuls per controlar adequadament la morfogènesi. S'ha identificat un gran nombre de molècules responsables de la regulació de l'activitat dels microtúbuls, i la investigació relacionada encara està en curs3,4,28. La nostra comprensió actual de la dinàmica dels microtúbuls a les cèl·lules vegetals no explica completament els mecanismes d'organització dels microtúbuls corticals. Per exemple, tot i que tant la disopiramida com l'orizalina poden despolimeritzar els microtúbuls, la disopiramida causa una distorsió greu de les arrels, mentre que l'orizalina té un efecte relativament lleu. A més, les mutacions en la tubulina, que estabilitza els microtúbuls, també causen dextrorotació a les arrels, mentre que el paclitaxel, que també estabilitza la dinàmica dels microtúbuls, no ho fa. Per tant, estudiar i identificar les dianes moleculars de l'àcid ursòlic hauria de proporcionar nous coneixements sobre la regulació dels microtúbuls corticals de les plantes. De la mateixa manera, les futures comparacions de productes químics que són eficaços per promoure un creixement distorsionat, com la disopiramida, i productes químics menys eficaços, com l'orizalina o l'àcid kumamotric, proporcionaran pistes sobre com es produeix el creixement distorsionat.
D'altra banda, els reordenaments del citoesquelet relacionats amb la defensa són una altra possibilitat per explicar la citotoxicitat de l'àcid ursònic. La infecció d'un patogen o la introducció d'un elicitor a les cèl·lules vegetals de vegades provoca la destrucció del citoesquelet i la posterior mort cel·lular29. Per exemple, s'ha informat que la criptoxantina derivada d'oomicets altera els microtúbuls i els filaments d'actina abans de la mort de les cèl·lules del tabac, de manera similar al que passa amb el tractament amb KAND30,31. Les similituds entre les respostes de defensa i les respostes cel·lulars induïdes per l'àcid ursònic ens van portar a la hipòtesi que desencadenen processos cel·lulars comuns, tot i que és evident un efecte més ràpid i fort de l'àcid ursònic que la criptoxantina. Tanmateix, els estudis han demostrat que la disrupció dels filaments d'actina promou la mort cel·lular espontània, que no sempre va acompanyada d'una disrupció dels microtúbuls29. A més, queda per veure si el patogen o l'elicitor causen un creixement distorsionat de les arrels, com fan els derivats de l'àcid ursònic. Per tant, el coneixement molecular que vincula les respostes de defensa i el citoesquelet és un problema atractiu a abordar. Aprofitant la presència de compostos de baix pes molecular relacionats amb l'àcid ursònic, així com una gamma de derivats amb diferents potències, poden oferir oportunitats per atacar mecanismes cel·lulars desconeguts.
En conjunt, el descobriment i l'aplicació de nous compostos que modulen la dinàmica dels microtúbuls proporcionaran mètodes potents per abordar els complexos mecanismes moleculars subjacents a la determinació de la forma de les cèl·lules vegetals. En aquest context, el compost recentment desenvolupat, l'àcid urmotònic, que afecta els microtúbuls i els filaments d'actina i indueix la mort cel·lular, pot oferir una oportunitat per desxifrar la connexió entre el control dels microtúbuls i aquests altres mecanismes. Per tant, l'anàlisi química i biològica mitjançant àcid urbenònic ens ajudarà a comprendre els mecanismes reguladors moleculars que controlen el citoesquelet vegetal.
Inocular S. werraensis MK493-CF1 en un matràs Erlenmeyer amb deflector de 500 mL que conté 110 mL de medi de sembra que consisteix en un 2% (p/v) de galactosa, un 2% (p/v) de pasta Essence, un 1% (p/v) de composició Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), un 0,5% (p/v) d'extracte de blat de moro (KOGOSTCH Co., Ltd., Japó), un 0,2% (p/v) de (NH4)2SO4 i un 0,2% de CaCO3 en aigua desionitzada (pH 7,4 abans de l'esterilització). Els cultius de sembra es van incubar en un agitador rotatori (180 rpm) a 27 °C durant 2 dies. Cultiu de producció mitjançant fermentació en estat sòlid. El cultiu de llavors (7 ml) es va transferir a un matràs K-1 de 500 ml que contenia 40 g de medi de producció format per 15 g d'ordi premsat (MUSO Co., Ltd., Japó) i 25 g d'aigua desionitzada (pH no ajustat abans de l'esterilització). La fermentació es va dur a terme a 30 °C a les fosques durant 14 dies. El material de fermentació es va extreure amb 40 ml/ampolla d'EtOH i es va centrifugar (1500 g, 4 °C, 10 min). El sobrenedant del cultiu (60 ml) es va extreure amb una barreja de MeOH/EtOAc al 10%. La capa orgànica es va evaporar a pressió reduïda per obtenir un residu (59,5 mg), que es va sotmetre a HPLC amb elució en gradient (0–10 minuts: 90%) en una columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longitud 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuts: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuts: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuts: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100% EtOH) a un cabal d'1,5 ml/min, i es va aïllar cumamonamida (1, 36,0 mg) com una pols amorfa blanca.
Kumamotoamida(1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculat: 141,0659, valor mesurat: 141,0663, IR νmàx 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Les llavors de Columbia (Col-0) es van obtenir del Centre de Recursos Biològics d'Arabidopsis (ABRC) amb permís per a ús en recerca. Les llavors de Col-0 es van propagar i mantenir en les nostres condicions de laboratori i es van utilitzar com a plantes d'Arabidopsis de tipus salvatge. Les llavors d'Arabidopsis es van esterilitzar superficialment i es van cultivar en un medi Murashige i Skoog de concentració mitjana que contenia un 2% de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), un 0,05% (p/v) d'àcid 2-(4-morfolino)etanosulfònic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) i un 1,5% d'agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C i llum constant. Les llavors del mutant phs1-1 van ser proporcionades per T. Hashimoto (Institut de Ciència i Tecnologia de Nara).
Les llavors de la soca SR-1 van ser proporcionades per T. Hashimoto (Institut de Ciència i Tecnologia de Nara) i es van utilitzar com a plantes de tabac de tipus silvestre. Les llavors de tabac es van esterilitzar superficialment i es van submergir en aigua estèril durant tres nits per promoure la germinació, després es van col·locar en una solució a la meitat de la concentració que contenia un 2% de sacarosa, un 0,05% (p/v) de MES i un 0,8% de goma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) (medi Murashige i Skoog) amb pH 5,7 i es van incubar a 23 °C sota llum constant.
La soca Tak-1 va ser proporcionada per T. Kohchi (Universitat de Kyoto) i es va utilitzar com a unitat experimental estàndard per a l'estudi de l'hepàtica. La gemma es va obtenir de plantes de cultiu esterilitzades i després es va sembrar en un medi Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) que contenia 1% de sacarosa i 0,3% de goma gellan i es va incubar a 23 °C sota llum contínua.
Les cèl·lules BY-2 del tabac (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) van ser proporcionades per S. Hasezawa (Universitat de Tòquio). Les cèl·lules BY-2 es van diluir 95 vegades en un medi Linsmeier i Skoog modificat i es van suplementar setmanalment amb àcid 2,4-diclorofenoxiacètic 32. La suspensió cel·lular es va barrejar en un agitador rotatori a 130 rpm a 27 °C a les fosques. Rentar les cèl·lules amb 10 vegades el volum de medi fresc i resuspendre-les en el mateix medi. Les línies cel·lulars transgèniques BY-2 que expressen de manera estable el marcador de microtúbuls TagRFP-TUA6 o el marcador de filaments d'actina GFP-ABD2 sota el promotor 35S del virus del mosaic de la coliflor es van generar tal com es descriu 33,34,35. Aquestes línies cel·lulars es poden mantenir i sincronitzar mitjançant procediments similars als utilitzats per a la línia cel·lular BY-2 original.
Les cèl·lules HeLa es van cultivar en medi Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) suplementat amb un 10% de sèrum fetal boví, 1,2 U/ml de penicil·lina i 1,2 μg/ml d'estreptomicina en una incubadora a 37°C amb un 5% de CO2.
Tots els experiments descrits en aquest manuscrit es van dur a terme d'acord amb les normes i directrius de bioseguretat japoneses.
Els compostos es van dissoldre en dimetilsulfòxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) com a solucions stock i es van diluir en medi MS per a Arabidopsis i tabac o medi Gamborg B5 per a hepàtica. Per a l'assaig d'inhibició del creixement de les arrels, es van sembrar més de 10 llavors per placa en un medi d'agar que contenia els compostos indicats o DMSO. Les llavors es van incubar en una cambra de creixement durant 7 dies. Es van fotografiar les plàntules i es va mesurar la longitud de les arrels. Per a l'assaig de germinació d'Arabidopsis, es van sembrar 48 llavors per placa en un medi d'agar que contenia 200 μM de compost o DMSO. Les llavors d'Arabidopsis es van cultivar en una cambra de creixement i el nombre de plàntules germinades es va comptar 7 dies després de la germinació (dag). Per a l'assaig de germinació del tabac, es van sembrar 24 llavors per placa en un medi d'agar que contenia 200 μM de KAND o DMSO. Les llavors de tabac es van cultivar en una cambra de creixement i el nombre de plàntules germinades es va comptar després de 14 dies. Per a l'assaig d'inhibició del creixement de l'hepàtica, 9 embrions de cada placa es van sembrar en un medi d'agar que contenia les concentracions indicades de KAND o DMSO i es van incubar en una cambra de creixement durant 14 dies.
Utilitzeu plàntules tenyides amb 5 mg/ml de iodur de propidi (PI) per visualitzar l'organització del meristem radicular. Els senyals de PI es van observar mitjançant microscòpia de fluorescència utilitzant un microscopi confocal de rastreig làser TCS SPE (Leica Microsystems).
La tinció histoquímica de les arrels amb β-glucuronidasa (GUS) es va dur a terme segons el protocol descrit per Malami i Benfey36. Les plàntules es van fixar en acetona al 90% durant la nit, es van tenyir amb 0,5 mg/ml d'àcid 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurònic en tampó GUS durant 1 hora i es van col·locar en una solució de cloraldehid hidratada (8 g d'hidrat de cloral, 2 ml d'aigua i 1 ml de glicerol) i es van observar mitjançant microscòpia de contrast d'interferència diferencial utilitzant un microscopi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Els angles de les arrels es van mesurar en plàntules de 7 dies cultivades en plaques col·locades verticalment. Mesureu l'angle de l'arrel respecte a la direcció del vector de gravetat tal com es descriu al pas 6.
La disposició dels microtúbuls corticals es va observar tal com es descriu, amb petites modificacions al protocol 37. L'anticòs anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i l'IgG anti-ratolí conjugada amb Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) es van utilitzar com a anticossos primaris i secundaris a dilucions 1:1000 i 1:100, respectivament. Les imatges de fluorescència es van adquirir mitjançant un microscopi confocal d'escaneig làser TCS SPE (Leica Microsystems). Adquiriu imatges Z-stack i creeu projeccions d'intensitat màxima segons les instruccions del fabricant.
L'assaig de proliferació de cèl·lules HeLa es va realitzar utilitzant el kit de recompte cel·lular 8 (Dojindo) segons les instruccions del fabricant.
El creixement d'E. coli DH5α es va analitzar mesurant la densitat cel·lular en cultiu utilitzant un espectrofotòmetre a 600 nm (DO600).
L'organització del citoesquelet en cèl·lules transgèniques BY-2 es va observar mitjançant un microscopi de fluorescència equipat amb un dispositiu d'escaneig confocal CSU-X1 (Yokogawa) i una càmera sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densitat del citoesquelet es va avaluar mitjançant anàlisi d'imatges, que va quantificar el percentatge de píxels del citoesquelet entre els píxels citoplasmàtics en imatges confocals utilitzant el programari ImageJ tal com es descriu38,39.
Per detectar la mort cel·lular en cèl·lules BY-2, es va incubar una alíquota de la suspensió cel·lular amb blau Evans al 0,05% durant 10 minuts a temperatura ambient. La tinció selectiva amb blau Evans de les cèl·lules mortes depèn de l'extrusió del colorant de les cèl·lules viables per la membrana plasmàtica intacta40. Les cèl·lules tenyides es van observar mitjançant un microscopi de camp brillant (BX53, Olympus).
Les cèl·lules HeLa es van cultivar en DMEM suplementat amb FBS al 10% en una incubadora humidificada a 37 °C i CO2 al 5%. Les cèl·lules es van tractar amb KAND 11 100 μM, àcid kumamonàmic 6, kumamonamida 1, colcemid (Gibco) 100 ng/ml o Nocodmaze (Sigma) 100 ng/ml durant 6 h a 37 °C. Les cèl·lules es van fixar amb MetOH durant 10 min i després amb acetat durant 5 min a temperatura ambient. Les cèl·lules fixades es van incubar amb anticòs primari de β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluït en BSA/PBS al 0,5% durant 2 hores, es van rentar 3 vegades amb TBST i després es van incubar amb anticòs de cabra Alexa Fluor. 488 1 hora. – IgG de ratolí (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluït en 0,5% de BSA/PBS. Després de rentar-les amb TBST tres vegades, es van observar les cèl·lules tenyides en un microscopi invertit Nikon Eclipse Ti-E. Les imatges es van capturar amb una càmera CCD Hamamatsu ORCA-R2 refredada mitjançant el programari MetaMorph (Molecular Devices).
Data de publicació: 17 de juny de 2024