Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat. Per obtenir els millors resultats, us recomanem que utilitzeu una versió més recent del vostre navegador (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per garantir un suport permanent, estem mostrant el lloc sense estil ni JavaScript.
El descobriment i l'ús beneficiós de productes naturals poden ajudar a millorar la vida humana. Els productes químics inhibidors del creixement de les plantes s'utilitzen àmpliament com a herbicides per controlar les males herbes. Degut a la necessitat d'utilitzar diferents tipus d'herbicides, es fa necessari identificar compostos amb nous mecanismes d'acció. En aquest estudi, vam descobrir un nou compost de N-alcoxipirrol, cumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 i vam establir el procés de síntesi complet. Mitjançant assaigs d'activitat biològica, vam descobrir que l'àcid urs-monoamic és un intermedi sintètic de la urs-monoamida i un potencialinhibidor del creixement de les plantes. A més, hem desenvolupat diversos derivats de l'àcid urbenònic, inclòs el derivat d'urbeniloxi (UDA), que té una alta activitat herbicida sense afectar negativament el creixement de les cèl·lules HeLa. També vam trobar que els derivats de l'àcid urmotònic alteraven els microtúbuls de les plantes; a més, KAND afecta els filaments d'actina i indueix la mort cel·lular; Aquests efectes polièdrics difereixen dels dels inhibidors de microtúbuls coneguts i suggereixen un nou mecanisme d'acció de l'àcid ursònic, que representa un avantatge important en el desenvolupament de nous herbicides.
El descobriment i l'aplicació pràctica de productes naturals beneficiosos i els seus derivats és un mitjà per millorar la qualitat de vida humana. Els metabòlits secundaris produïts per microorganismes, plantes i insectes han donat lloc a grans avenços en medicina i agricultura. Molts antibiòtics i fàrmacs contra la leucèmia s'han desenvolupat a partir de productes naturals. A més, diversos tipus depesticides, d'aquests productes naturals s'extreuen fungicides i herbicides per utilitzar-los en l'agricultura. En particular, els herbicides per al control de males herbes són eines importants per augmentar el rendiment dels cultius en l'agricultura moderna, i ja s'utilitzen comercialment diversos tipus de compostos. Diversos processos cel·lulars a les plantes, com ara la fotosíntesi, el metabolisme dels aminoàcids, la síntesi de la paret cel·lular, la regulació de la mitosi, la senyalització de fitohormones o la síntesi de proteïnes, es consideren objectius típics dels herbicides. Els compostos que inhibeixen la funció dels microtúbuls són una classe comuna d'herbicides que afecten el creixement de les plantes afectant la regulació mitòtica2.
Els microtúbuls són components del citoesquelet i es conserven àmpliament a les cèl·lules eucariotes. L'heterodímer de tubulina consisteix en α-tubulina i β-tubulina que formen protofilaments de microtúbuls lineals, amb 13 protofilaments que formen una estructura cilíndrica. Els microtúbuls tenen múltiples papers a les cèl·lules vegetals, inclosa la determinació de la forma cel·lular, la divisió cel·lular i el transport intracel·lular3,4. Les cèl·lules vegetals contenen microtúbuls sota la membrana plasmàtica d'interfase, i es creu que aquests anomenats microtúbuls corticals controlen l'organització de les microfibrilles de cel·lulosa mitjançant la regulació dels complexos de cel·lulosa sintasa4,5. Els microtúbuls corticals de les cèl·lules epidèrmiques de l'arrel, presents a la zona de ràpid allargament de la punta de l'arrel, es troben lateralment, i les microfibres de cel·lulosa segueixen aquests microtúbuls i limiten la direcció d'expansió cel·lular, afavorint així l'allargament anisotròpic de les cèl·lules. Per tant, la funció dels microtúbuls està estretament relacionada amb la morfologia de les plantes. Les substitucions d'aminoàcids en els gens que codifiquen la tubulina provoquen una inclinació de les matrius de microtúbuls corticals i un creixement del costat esquerre o dret a Arabidopsis 6,7. De la mateixa manera, les mutacions en proteïnes associades als microtúbuls que regulen la dinàmica dels microtúbuls també poden provocar un creixement de l'arrel distorsionat8,9,10,11,12,13. A més, el tractament amb herbicides que alteran els microtúbuls com la disopiramida, també coneguda com a pretilaclor, també provoca el creixement de l'arrel obliqua del costat esquerre14. Aquestes dades indiquen que la regulació precisa de la funció dels microtúbuls és fonamental per determinar la direcció del creixement de les plantes.
S'han descobert diversos tipus d'inhibidors de microtúbuls, i aquests fàrmacs han fet contribucions importants a la investigació del citoesquelet, així com a l'agricultura i la medicina2. En particular, l'orizalina, els compostos de dinitroanilina, la disopiramida, els compostos relacionats amb la benzamida i els seus anàlegs poden inhibir la funció dels microtúbuls i, per tant, inhibir el creixement de les plantes. Per tant, s'utilitzen àmpliament com a herbicides. Tanmateix, com que els microtúbuls són un component important de les cèl·lules vegetals i animals, la majoria dels inhibidors de microtúbuls són citotòxics per a ambdós tipus de cèl·lules. Per tant, malgrat la seva utilitat reconeguda com a herbicides, s'utilitzen un nombre limitat d'agents antimicrotúbuls amb finalitats pràctiques.
Streptomyces és un gènere de la família Streptomyces, que inclou bacteris aeròbics, grampositius i filamentosos i és àmpliament conegut per la seva capacitat de produir una àmplia gamma de metabòlits secundaris. Per tant, es considera una de les fonts més importants de nous productes naturals biològicament actius. En l'estudi actual, hem descobert un nou compost anomenat cumamonamida, que es va aïllar de Streptomyces werraensis MK493-CF1 i S. werraensis ISP 5486. Mitjançant anàlisi espectral i anàlisi espectral completa, es va caracteritzar l'estructura de la cumamonamida i el seu esquelet únic de N-alcoxipirrol. estava determinat. síntesi. Es va trobar que l'àcid ursmònic, un intermedi sintètic de la ursmonoamida i els seus derivats, inhibeix el creixement i la germinació de la popular planta model Arabidopsis thaliana. En un estudi de relació estructura-activitat, vam trobar que un compost amb C9 modificat en àcid ursònic, anomenat derivat de noniloxi de l'àcid ursònic (KAND), millora significativament l'efecte inhibidor sobre el creixement i la germinació. En particular, l'inhibidor del creixement de les plantes recentment descobert també va afectar el creixement del tabac i l'herba hepàtica i no era citotòxic per als bacteris o les cèl·lules HeLa. A més, alguns derivats de l'àcid urmotònic indueixen un fenotip de l'arrel distorsionat, la qual cosa implica que aquests derivats afecten directament o indirectament els microtúbuls. D'acord amb aquesta idea, les nostres observacions de microtúbuls marcats immunohistoquímicament o amb proteïnes fluorescents indiquen que el tractament KAND despolimeritza els microtúbuls. A més, el tractament amb derivats de l'àcid kumamotònic va alterar els microfilaments d'actina. Així, hem descobert un nou inhibidor del creixement de les plantes el mecanisme d'acció únic del qual implica la destrucció del citoesquelet.
La soca MK493-CF1 es va aïllar del sòl a Shinagawa-ku, Tòquio. La soca MK493-CF1 va formar miceli estromal ben ramificat. Es va determinar la seqüència parcial del gen de l'ARN ribosòmic 16S (1422 pb). Aquesta soca és molt semblant a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: soca típica, 99,93%). A partir d'aquest resultat, es va determinar que aquesta soca estava estretament relacionada amb la soca tipus de S. werraensis. Per tant, vam anomenar provisionalment aquesta soca S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T també produeix els mateixos compostos bioactius. Com que hi va haver poca investigació primerenca sobre l'obtenció de productes naturals a partir d'aquest microorganisme, es van dur a terme més investigacions químiques. Després del cultiu de S. werraensis MK493-CF1 en medi d'ordi mitjançant fermentació en estat sòlid a 30 °C durant 14 dies, el medi es va extreure amb EtOH al 50%. Es van assecar 60 ml de mostra per obtenir 59,5 mg d'extracte brut. L'extracte brut es va sotmetre a HPLC en fase inversa per donar N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, anomenada cumamonamida, 36,0 mg). La quantitat total d'1 és aproximadament el 60% de l'extracte brut. Per tant, vam decidir estudiar amb detall les propietats de la kumamotoamida 1.
La coumamonamida 1 és una pols amorfa blanca i l'espectrometria de masses d'alta resolució (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1). El fragment de pirrol substituït amb C2 d'aquest compost es caracteritza per δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH en l'espectre de RMN 1H: 4,5 Hz). , H-5) i δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), i l'espectre de RMN 13C mostra la presència de quatre àtoms de carboni sp2. La presència d'un grup amida a la posició C2 es va avaluar mitjançant la correlació HMBC del protó C-3 al carboni carbonil amida a δC 161,1. A més, els pics de RMN 1H i 13C a δH 4,10 (3H, S) i δC 68,3 indiquen la presència de grups N-metoxi a la molècula. Tot i que encara no s'havia determinat la posició correcta del grup metoxi mitjançant l'anàlisi espectroscòpica com l'espectroscòpia de diferència millorada i l'abreviatura nuclear Overhauser (NOEDF), la N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida es va convertir en el primer compost candidat.
Per determinar l'estructura correcta d'1, es va realitzar una síntesi total (Fig. 2a). El tractament de la 2-aminopiridina 2 disponible comercialment amb m-CPBA va donar lloc al rendiment quantitatiu del N-òxid 3 corresponent. Després de la 2-aminoazidació de 2, la reacció de ciclocondensació descrita per Abramovich es va dur a terme en benzè a 90 ° C per obtenir l'1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitril desitjat 5 en grams. Velocitat 60% (dues etapes). 15,16. La metilació i la hidròlisi de 4 van donar llavors àcid 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílic (anomenat "àcid cumotònic", 6) amb un bon rendiment (70%, dos passos). Finalment, l'amidació mitjançant l'intermedi 6 de clorur àcid mitjançant amoníac aquós va donar a l'amida 1 de Kumamoto amb un rendiment del 98%. Totes les dades espectrals de l'1 sintetitzat eren similars a l'1 aïllat, de manera que es va determinar l'estructura d'1;
Síntesi general i anàlisi de l'activitat biològica de l'urbenamida i l'àcid urbènic. ( a ) Síntesi total d'amida de Kumamoto. ( b ) Les plàntules d'Arabidopsis Columbia (Col) de tipus salvatge de set dies es van cultivar en plaques Murashige i Skoog (MS) que contenien cumamonamida 6 o cumamonamida 1 a les concentracions indicades. Barra d'escala = 1 cm.
En primer lloc, es van avaluar les activitats biològiques de l'urbenamida i els seus intermedis per la seva capacitat per modular el creixement de les plantes. Hem afegit diverses concentracions d'ursmonamida 1 o àcid ursmònic 6 al medi d'agar MS i hem cultivat plàntules d'Arabidopsis thaliana en aquest medi. Aquests assajos van demostrar que altes concentracions (500 μM) de 6 inhibien el creixement de les arrels (Fig. 2b). A continuació, vam generar diverses derivades substituint la posició N1 de 6 i vam realitzar estudis de relació estructura-activitat sobre elles (el procés de síntesi analògica es descriu a la informació de suport (SI)). Les plàntules d'Arabidopsis es van cultivar en un medi que contenia 50 μM de derivats d'àcid ursònic i es va mesurar la longitud de l'arrel. tal com es mostra a la imatge. Com es mostra a les figures 3a, b i S1, els àcids cumamo tenen diferents longituds de cadenes alcoxi lineals (9, 10, 11, 12 i 13) o cadenes alcoxi grans (15, 16 i 17) a la posició N1. Els derivats van mostrar una inhibició significativa del creixement de les arrels. A més, vam trobar que l'aplicació de 200 μM 10, 11 o 17 inhibia la germinació (Figs. 3c i S2).
Estudi de la relació estructura-activitat de l'amida de Kumamoto i els seus compostos relacionats. (a) Estructura i esquema de síntesi dels anàlegs. ( b ) Quantificació de la longitud de l'arrel de plàntules de 7 dies cultivades en medi MS amb o sense derivats de cumamonamida 50 μM. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (test t, pàg<0,05). n>18. Les dades es mostren com a mitjana ± SD. nt significa "no provat" perquè més del 50% de les llavors no van germinar. ( c ) Quantificació de la taxa de germinació de les llavors tractades incubades durant 7 dies en medi MS amb o sense 200 μM de cumamonamida i compostos relacionats. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (prova de chi quadrat). n=96.
Curiosament, l'addició de cadenes laterals alquils més llargues que C9 va reduir l'activitat inhibidora, cosa que suggereix que els compostos relacionats amb l'àcid kumamotoic requereixen cadenes laterals d'una certa mida per mostrar la seva activitat biològica.
Com que l'anàlisi de la relació estructura-activitat va mostrar que C9 es va modificar a àcid ursònic i el derivat noniloxi de l'àcid ursònic (en endavant KAND 11) era l'inhibidor de creixement de les plantes més eficaç, vam realitzar una caracterització més detallada de KAND 11. Tractament d'Arabidopsis amb 50 μM KAND 11 va impedir gairebé completament la germinació, mentre que les concentracions més baixes (40, 30, 20 o 10 μM) de KAND 11 va inhibir el creixement de les arrels de manera dependent de la dosi (Fig. 4a, b). Per provar si KAND 11 afecta la viabilitat del meristem arrel, vam examinar els meristemes d'arrel tenyits amb iodur de propidi (PI) i vam mesurar la mida de l'àrea del meristema. La mida del meristema de les plàntules cultivades en un medi que contenia 25 μM KAND-11 era de 151,1 ± 32,5 μm, mentre que la mida del meristema de les plàntules cultivades en un medi de control que contenia DMSO era de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , que indica que KAND-11 restaura l'activitat cel·lular. estenent. Meristema arrel. D'acord amb això, el tractament amb KAND 11 va reduir la quantitat de senyal del marcador de divisió cel·lular CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS al meristema arrel (Fig. 4e) 17 . Aquests resultats indiquen que KAND 11 inhibeix el creixement de les arrels reduint l'activitat de proliferació cel·lular.
Anàlisi de l'efecte inhibidor dels derivats de l'àcid urbenònic (derivats d'urbeniloxi) sobre el creixement. (a) Plantes de Col de tipus salvatge de 7 dies cultivades en plaques MS amb les concentracions indicades de KAND 11. Barra d'escala = 1 cm. (b) Quantificació de la longitud de l'arrel. Les lletres indiquen diferències significatives (test de Tukey HSD, pàg<0,05). n>16. Les dades es mostren com a mitjana ± SD. (c) Microscòpia confocal d'arrels Col de tipus salvatge tenyides amb iodur de propidi cultivades en plaques MS amb o sense 25 μM KAND 11. Els claudàtors blancs indiquen el meristema de l'arrel. Barra d'escala = 100 µm. (d) Quantificació de la mida del meristema arrel (n = 10 a 11). Les diferències estadístiques es van determinar mitjançant la prova t (p<0,05). Les barres representen la mida mitjana dels meristemes. ( e ) Microscòpia de contrast d'interferència diferencial (DIC) d'un meristema arrel que conté la construcció CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS tenyit i tenyit en plàntules de 5 dies cultivades en plaques MS amb o sense assaig KAND de 25 µM.
La fitotoxicitat de KAND 11 es va provar més amb una altra planta dicotiledónea, el tabac (Nicotiana tabacum) i un organisme model de planta terrestre important, l'herba hepàtica (Marchantia polymorpha). Com en el cas d'Arabidopsis, les plàntules de tabac SR-1 cultivades en un medi que contenia 25 μM de KAND 11 van produir arrels més curtes (Fig. 5a). A més, 40 de les 48 llavors van germinar en plaques que contenien 200 μM de KAND 11, mentre que les 48 llavors van germinar en medis tractats amb simulacre, cosa que indica que les concentracions més altes de KAND eren significatives (p.< 0,05; prova de chi -quadrat) va inhibir la germinació del tabac. (Fig. 5b). A més, la concentració de KAND 11 que va inhibir el creixement bacterià de l'herba hepàtica era similar a la concentració efectiva d'Arabidopsis (Fig. 5c). Aquests resultats indiquen que KAND 11 pot inhibir el creixement d'una varietat de plantes. A continuació, es va investigar la possible citotoxicitat dels compostos relacionats amb la monoamida de l'ós en altres organismes, és a dir, les cèl·lules humanes HeLa i la soca d'Escherichia coli DH5α, com a representants de cèl·lules animals i bacterianes superiors, respectivament. En una sèrie d'assajos de proliferació cel·lular, vam observar que la cumamonamida 1, l'àcid cumamonamídic 6 i el KAND 11 no van afectar el creixement de cèl·lules HeLa o E. coli a concentracions de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibició del creixement de KAND 11 en organismes que no siguin Arabidopsis. ( a ) Les plàntules de tabac SR-1 de tipus salvatge de dues setmanes es van cultivar en plaques MS posicionades verticalment que contenien 25 μM KAND 11. (b) Les plàntules de tabac SR-1 de tipus salvatge de dues setmanes es van cultivar en posició horitzontal. Plaques MS que contenen 200 μM KAND 11. (c) Tak-1 de tipus salvatge de dues setmanes brots d'herba hepàtica cultivades en plaques Gamborg B5 amb les concentracions indicades de KAND 11. Les fletxes vermelles indiquen espores que van deixar de créixer durant el període d'incubació de dues setmanes. ( d ) Assaig de proliferació cel·lular de cèl·lules HeLa. El nombre de cèl·lules viables es va mesurar a intervals de temps fixos mitjançant un kit de recompte de cèl·lules 8 (Dojindo). Com a control, les cèl·lules HeLa es van tractar amb 5 μg/ml d'actinomicina D (Act D), que inhibeix la transcripció de l'ARN polimerasa i provoca la mort cel·lular. Les anàlisis es van fer per triplicat. ( e ) Assaig de proliferació cel·lular d'E. coli. El creixement d'E. coli es va analitzar mesurant la DO600. Com a control, les cèl·lules es van tractar amb 50 μg/ml d'ampicil·lina (Amp), que inhibeix la síntesi de la paret cel·lular bacteriana. Les anàlisis es van fer per triplicat.
Per desxifrar el mecanisme d'acció de la citotoxicitat causada per compostos relacionats amb la uramida, hem reanalitzat els derivats de l'àcid urbènic amb efectes inhibidors moderats. tal com es mostra a la imatge. Com es mostra a les figures 2b, 6a, les plàntules cultivades en plaques d'agar que contenien altes concentracions (200 μM) d'àcid urmotònic 6 van produir arrels més curtes i corbes a l'esquerra (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre que de les plàntules cultivades en el medi de control, el les plàntules van produir arrels gairebé rectes (θ = – 3,8 ± 7,1). Se sap que aquest creixement oblic característic és el resultat de la disfunció dels microtúbuls corticals14,18. D'acord amb aquesta troballa, els fàrmacs desestabilitzadors de microtúbuls disopiramida i orizalina van induir una inclinació de l'arrel similar en les nostres condicions de creixement (Figs. 2b, 6a). Al mateix temps, vam provar derivats de l'àcid urmotònic i vam seleccionar-ne diversos que, a determinades concentracions, induïen el creixement de l'arrel obliqua. Els compostos 8, 9 i 15 van canviar la direcció del creixement de les arrels a 75 μM, 50 μM i 40 μM, respectivament, cosa que indica que aquests compostos poden desestabilitzar efectivament els microtúbuls (Fig. 2b, 6a). També vam provar el derivat més potent de l'àcid ursòlic, KAND 11, a una concentració més baixa (15 µM) i vam trobar que l'aplicació de KAND 11 inhibeix el creixement de les arrels i que la direcció del creixement de les arrels era desigual, tot i que tendien a inclinar-se cap a l'esquerra ( Figura C3). . Com que les concentracions més elevades de fàrmacs desestabilitzadors de microtúbuls de vegades inhibeixen el creixement de les plantes en lloc de provocar la inclinació de l'arrel, posteriorment vam avaluar la possibilitat que KAND 11 afecti els microtúbuls observant els microtúbuls corticals a les cèl·lules epidèrmiques de l'arrel. La immunohistoquímica utilitzant anticossos anti-β-tubulina en cèl·lules epidèrmiques d'arrels de plàntules tractades amb 25 μM KAND 11 va mostrar la desaparició de gairebé tots els microtúbuls corticals a les cèl·lules epidèrmiques de la zona d'allargament (Fig. 6b). Aquests resultats indiquen que l'àcid kumamotònic i els seus derivats actuen directament o indirectament sobre els microtúbuls per alterar-los i que aquests compostos són nous inhibidors de microtúbuls.
L'àcid ursònic i els seus derivats alteren els microtúbuls corticals a Arabidopsis thaliana. (a) Angle d'inclinació de l'arrel mesurat en presència de diversos derivats de l'àcid urmotònic a les concentracions indicades. També es van analitzar els efectes de dos compostos coneguts per inhibir els microtúbuls: la disopiramida i l'orizalina. El requadre mostra l'estàndard utilitzat per mesurar l'angle de creixement de les arrels. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (test t, pàg<0,05). n>19. Barra d'escala = 1 cm. ( b ) Microtúbuls corticals a les cèl·lules epidèrmiques de la zona d'allargament. Els microtúbuls de les arrels d'Arabidopsis Col de tipus salvatge cultivades en plaques MS amb o sense 25 μM KAND 11 es van visualitzar mitjançant una tinció immunohistoquímica mitjançant anticossos primaris β-tubulina i anticossos secundaris conjugats amb Alexa Fluor. Barra d'escala = 10 µm. (c) Estructura mitòtica dels microtúbuls al meristema de l'arrel. Els microtúbuls es van visualitzar mitjançant una tinció immunohistoquímica. Les estructures mitòtiques, incloses les zones de profase, els fusos i els fragmoplasts, es van comptar a partir d'imatges confocals. Les fletxes indiquen estructures de microtúbuls mitòtics. Els asteriscs indiquen diferències significatives amb el tractament simulat (test t, pàg<0,05). n>9. Barra d'escala = 50 µm.
Tot i que Ursa té la capacitat d'interrompre la funció dels microtúbuls, s'espera que el seu mecanisme d'acció sigui diferent dels típics agents despolimeritzants de microtúbuls. Per exemple, concentracions més altes d'agents despolimeritzants de microtúbuls com la disopiramida i l'orizalina indueixen l'expansió anisotròpica de les cèl·lules epidèrmiques, mentre que KAND 11 no. A més, la coaplicació de KAND 11 i disopiramida va donar lloc a una resposta combinada de creixement de l'arrel induïda per disopiramida i es va observar una inhibició del creixement induïda per KAND 11 (Fig. S4). També hem analitzat la resposta del mutant hipersensible disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 té una mutació puntual de tubulina quinasa no canònica i produeix arrels més curtes quan es tracta amb disopiramida9,20. Les plàntules mutants phs1-1 cultivades en medi d'agar que contenien KAND 11 tenien arrels més curtes similars a les que es creixen en disopiramida (fig. S5).
A més, vam observar estructures de microtúbuls mitòtics, com zones de profase, fusos i fragmoplasts, al meristema arrel de les plàntules tractades amb KAND 11. D'acord amb les observacions de CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, una disminució significativa de es va observar el nombre de microtúbuls mitòtics (Fig. .6c).
Per caracteritzar la citotoxicitat de KAND 11 a resolució subcel·lular, vam tractar cèl·lules de suspensió BY-2 de tabac amb KAND 11 i vam observar la seva resposta. Primer vam afegir KAND 11 a cèl·lules BY-2 que expressen TagRFP-TUA6, que etiqueta fluorescentment els microtúbuls, per avaluar l'efecte de KAND 11 sobre els microtúbuls corticals. La densitat de microtúbuls corticals es va avaluar mitjançant l'anàlisi d'imatges, que va quantificar el percentatge de píxels citoesquelètics entre els píxels citoplasmàtics. Els resultats de l'assaig van mostrar que després del tractament amb 50 μM o 100 μM KAND 11 durant 1 hora, la densitat va disminuir significativament fins al 0, 94 ± 0, 74% o 0, 23 ± 0, 28%, respectivament, mentre que la densitat de cèl·lules tractades amb DMSO , va ascendir a ± 10361. % (Fig. 7a). Aquests resultats són coherents amb l'observació a Arabidopsis que el tractament amb KAND 11 indueix la despolimerització dels microtúbuls corticals (Fig. 6b). També vam examinar la línia BY-2 amb filaments d'actina marcats amb GFP-ABD després del tractament amb la mateixa concentració de KAND 11 i vam observar que el tractament amb KAND 11 va alterar els filaments d'actina. El tractament amb 50 μM o 100 μM KAND 11 durant 1 h va reduir significativament la densitat del filament d'actina a 1, 20 ± 0, 62% o 0, 61 ± 0, 26%, respectivament, mentre que la densitat a les cèl·lules tractades amb DMSO era de l'1, 69 ± 0, 52%. 7b). Aquests resultats contrasten amb els efectes de la propizamida, que no afecta els filaments d'actina, i la latrunculina B, un despolimeritzador d'actina que no afecta els microtúbuls (SI Figura S6). A més, el tractament amb cumamonamida 1, cumamonamida àcid 6 o KAND 11 no va afectar els microtúbuls de les cèl·lules HeLa (SI Figura S7). Així, es creu que el mecanisme d'acció de KAND 11 és diferent del dels disruptors del citoesquelet coneguts. A més, la nostra observació microscòpica de cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 va revelar l'inici de la mort cel·lular durant el tractament amb KAND 11 i va demostrar que la proporció de cèl·lules mortes tacades de blau d'Evans no va augmentar significativament després de 30 minuts de tractament amb KAND 11, mentre que després de 90 minuts de tractament amb 50 μM o 100 μM KAND, el nombre de cèl·lules mortes va augmentar fins al 43,7% o 80,1%, respectivament (Fig. 7c). En conjunt, aquestes dades indiquen que el nou derivat de l'àcid ursòlic KAND 11 és un inhibidor del citoesquelet específic de la planta amb un mecanisme d'acció desconegut anteriorment.
KAND afecta els microtúbuls corticals, els filaments d'actina i la viabilitat de les cèl·lules BY-2 del tabac. ( a ) Visualització de microtúbuls corticals a les cèl·lules BY-2 en presència de TagRFP-TUA6. Les cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO es van examinar mitjançant microscòpia confocal. La densitat de microtúbuls corticals es va calcular a partir de micrografies de 25 cèl·lules independents. Les lletres indiquen diferències significatives (test de Tukey HSD, pàg<0,05). Barra d'escala = 10 µm. ( b ) Filaments d'actina cortical a les cèl·lules BY-2 visualitzats en presència de GFP-ABD2. Les cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO es van examinar mitjançant microscòpia confocal. La densitat dels filaments d'actina corticals es va calcular a partir de micrografies de 25 cèl·lules independents. Les lletres indiquen diferències significatives (test de Tukey HSD, pàg<0,05). Barra d'escala = 10 µm. ( c ) Observació de cèl·lules BY-2 mortes mitjançant la tinció blava d'Evans. Les cèl·lules BY-2 tractades amb KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO es van examinar mitjançant microscòpia de camp brillant. n=3. Barra d'escala = 100 µm.
El descobriment i l'aplicació de nous productes naturals ha donat lloc a avenços significatius en diversos aspectes de la vida humana, incloent la medicina i l'agricultura. S'han dut a terme investigacions històriques per obtenir compostos útils a partir dels recursos naturals. En particular, se sap que els actinomicets són útils com a antibiòtics antiparasitaris per als nematodes per la seva capacitat per produir diversos metabòlits secundaris com l'avermectina, el compost principal de la ivermectina i la bleomicina i els seus derivats, utilitzats medicinalment com a agent anticancerígen21,22. Així mateix, s'han descobert una varietat de compostos herbicides a partir dels actinomicets, alguns dels quals ja s'utilitzen comercialment1,23. Per tant, l'anàlisi dels metabòlits d'actinomicet per aïllar productes naturals amb activitats biològiques desitjades es considera una estratègia eficaç. En aquest estudi, vam descobrir un nou compost, la cumamonamida, de S. werraensis i el vam sintetitzar amb èxit. L'àcid ursònic és un intermedi sintètic de l'urbenamida i els seus derivats. Pot provocar un enrotllament característic de les arrels, presentar una activitat herbicida de moderada a forta i danyar directament o indirectament els microtúbuls de les plantes. Tanmateix, el mecanisme d'acció de l'àcid urmotònic pot diferir del dels inhibidors de microtúbuls existents, ja que KAND 11 també altera els filaments d'actina i provoca la mort cel·lular, cosa que suggereix un mecanisme regulador pel qual l'àcid urmotònic i els seus derivats influeixen en una àmplia gamma d'estructures citoesquelètics. .
Una caracterització més detallada de l'àcid urbenònic ajudarà a entendre millor el mecanisme d'acció de l'àcid urbenònic. En particular, el següent objectiu és avaluar la capacitat de l'àcid ursònic d'unir-se a microtúbuls reduïts per determinar si l'àcid ursònic i els seus derivats actuen directament sobre els microtúbuls i els despolimeritzen, o si la seva acció provoca la desestabilització dels microtúbuls. A més, en el cas en què els microtúbuls no siguin un objectiu directe, identificar el lloc d'acció i els objectius moleculars de l'àcid ursònic a les cèl·lules vegetals ajudarà a entendre millor les propietats dels compostos relacionats i les possibles maneres de millorar l'activitat herbicida. El nostre assaig de bioactivitat va revelar la capacitat citotòxica única de l'àcid ursònic en el creixement de plantes com Arabidopsis thaliana, tabac i hepàtica, mentre que ni les cèl·lules E. coli ni HeLa es van veure afectades. La poca o cap toxicitat per a les cèl·lules animals és un avantatge dels derivats de l'àcid ursònic si es desenvolupen com a herbicides per al seu ús en camps agrícoles oberts. De fet, com que els microtúbuls són estructures comunes als eucariotes, la seva inhibició selectiva a les plantes és un requisit clau per als herbicides. Per exemple, la propizamida, un agent despolimeritzant de microtúbuls que s'uneix directament a la tubulina i inhibeix la polimerització, s'utilitza com a herbicida per la seva baixa toxicitat per a les cèl·lules animals24. A diferència de la disopiramida, les benzamides relacionades tenen diferents especificitats diana. A més dels microtúbuls vegetals, la RH-4032 o la benzoxamida també inhibeixen els microtúbuls de cèl·lules animals o oomicets, respectivament, i la zalilamida s'utilitza com a fungicida per la seva baixa fitotoxicitat25,26,27. L'ós recentment descobert i els seus derivats presenten citotoxicitat selectiva contra les plantes, però val la pena assenyalar que les modificacions posteriors poden alterar la seva especificitat objectiu, proporcionant potencialment derivats addicionals per al control de fongs patògens o oomicets.
Les propietats úniques de l'àcid urbenònic i els seus derivats són útils per al seu desenvolupament com a herbicides i ús com a eines de recerca. La importància del citoesquelet en el control de la forma de les cèl·lules vegetals és àmpliament reconeguda. Estudis anteriors han demostrat que les plantes han desenvolupat mecanismes complexos d'organització dels microtúbuls corticals controlant la dinàmica dels microtúbuls per controlar correctament la morfogènesi. S'han identificat un gran nombre de molècules responsables de la regulació de l'activitat dels microtúbuls i la investigació relacionada encara està en curs3,4,28. La nostra comprensió actual de la dinàmica dels microtúbuls a les cèl·lules vegetals no explica completament els mecanismes d'organització dels microtúbuls corticals. Per exemple, tot i que tant la disopiramida com l'orizalina poden despolimeritzar els microtúbuls, la disopiramida provoca una distorsió severa de l'arrel mentre que l'orizalina té un efecte relativament lleu. A més, les mutacions de la tubulina, que estabilitza els microtúbuls, també provoquen dextrorotació a les arrels, mentre que el paclitaxel, que també estabilitza la dinàmica dels microtúbuls, no ho fa. Per tant, estudiar i identificar les dianes moleculars de l'àcid ursòlic hauria de proporcionar nous coneixements sobre la regulació dels microtúbuls corticals de les plantes. De la mateixa manera, les comparacions futures de productes químics que són eficaços per afavorir el creixement distorsionat, com la disopiramida, i els productes químics menys efectius, com l'orizalina o l'àcid kumamotor, proporcionaran pistes sobre com es produeix el creixement distorsionat.
D'altra banda, els reordenaments citoesquelètics relacionats amb la defensa són una altra possibilitat per explicar la citotoxicitat de l'àcid ursònic. La infecció d'un patogen o la introducció d'un elicitador a les cèl·lules vegetals de vegades provoca la destrucció del citoesquelet i la mort cel·lular posterior29. Per exemple, s'ha informat que la criptoxantina derivada d'oomicets altera els microtúbuls i els filaments d'actina abans de la mort de les cèl·lules del tabac, de manera similar al que passa amb el tractament KAND30,31. Les similituds entre les respostes de defensa i les respostes cel·lulars induïdes per l'àcid ursònic ens van fer plantejar la hipòtesi que desencadenen processos cel·lulars comuns, tot i que és evident un efecte més ràpid i fort de l'àcid ursònic que la criptoxantina. Tanmateix, els estudis han demostrat que la ruptura dels filaments d'actina afavoreix la mort espontània de les cèl·lules, que no sempre s'acompanya d'una interrupció dels microtúbuls29. A més, cal veure si el patogen o l'elicitador provoca un creixement de l'arrel distorsionat, com fan els derivats de l'àcid ursònic. Així, el coneixement molecular que vincula les respostes de defensa i el citoesquelet és un problema atractiu que cal abordar. Aprofitant la presència de compostos de baix pes molecular relacionats amb l'àcid ursònic, així com una sèrie de derivats amb diferents potències, poden oferir oportunitats per orientar-se a mecanismes cel·lulars desconeguts.
En conjunt, el descobriment i l'aplicació de nous compostos que modulen la dinàmica dels microtúbuls proporcionaran mètodes potents per abordar els complexos mecanismes moleculars subjacents a la determinació de la forma de les cèl·lules vegetals. En aquest context, l'àcid urmotònic compost recentment desenvolupat, que afecta els microtúbuls i els filaments d'actina i indueix la mort cel·lular, pot oferir una oportunitat per desxifrar la connexió entre el control dels microtúbuls i aquests altres mecanismes. Així, l'anàlisi química i biològica amb àcid urbenònic ens ajudarà a entendre els mecanismes reguladors moleculars que controlen el citoesquelet vegetal.
Inoculeu S. werraensis MK493-CF1 en un matràs Erlenmeyer de 500 ml que conté 110 ml de medi de llavors que consisteix en un 2% (p/v) de galactosa, 2% (p/v) de pasta d'essència, 1% (p/v) de composició Bacto . -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), extracte de blat de moro al 0,5% (p/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Japó), 0,2% (p/v) (NH4)2SO4 i 0,2% CaCO3 en aigua desionitzada. (pH 7,4 abans de l'esterilització). Els cultius de llavors es van incubar en un agitador rotatiu (180 rpm) a 27 ° C durant 2 dies. Cultiu de producció mitjançant fermentació en estat sòlid. El cultiu de llavors (7 ml) es va transferir a un matràs K-1 de 500 ml que contenia 40 g de medi de producció format per 15 g d'ordi premsat (MUSO Co., Ltd., Japó) i 25 g d'aigua desionitzada (pH no ajustat). abans de l'esterilització). ). La fermentació es va dur a terme a 30 °C a la foscor durant 14 dies. El material de fermentació es va extreure amb 40 ml/ampolla EtOH i es va centrifugar (1500 g, 4 ° C, 10 min). El sobrenedant de cultiu (60 ml) es va extreure amb una barreja de MeOH/EtOAc al 10%. La capa orgànica es va evaporar a pressió reduïda per obtenir un residu (59,5 mg), que es va sotmetre a HPLC amb gradient d'elució (0-10 minuts: 90%) en una columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × longitud 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuts: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuts: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuts: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) a un cabal d'1,5 ml/min, cumamonamida (1, 36,0 mg) es va aïllar com una pols amorfa blanca.
Kumamotoamida (1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculat: 141,0659, valor mesurat: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm
Les llavors de Columbia (Col-0) es van obtenir del Centre de Recursos Biològics d'Arabidopsis (ABRC) amb permís per a la investigació. Les llavors de Col-0 es van propagar i mantenir en les nostres condicions de laboratori i es van utilitzar com a plantes d'Arabidopsis de tipus salvatge. Les llavors d'Arabidopsis es van esterilitzar superficialment i es van cultivar en un medi Murashige i Skoog de mitja força que contenia un 2% de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) àcid 2-(4-morfolino) etanosulfònic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ). ) i agar 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C i llum constant. Les llavors del mutant phs1-1 van ser proporcionades per T. Hashimoto (Institut de Ciència i Tecnologia de Nara).
Les llavors de la soca SR-1 van ser proporcionades per T. Hashimoto (Institut de Ciència i Tecnologia de Nara) i utilitzades com a plantes de tabac de tipus salvatge. Les llavors de tabac es van esterilitzar a la superfície i es van remullar en aigua estèril durant tres nits per afavorir la germinació, després es van col·locar en una solució de mitja concentració que contenia 2% de sacarosa, 0,05% (p/v) de MES i 0,8% de goma gelana (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. i medi Skoog) amb pH 5,7 i incubat a 23 °C sota llum constant.
La soca Tak-1 va ser proporcionada per T. Kohchi (Universitat de Kyoto) i es va utilitzar com a unitat experimental estàndard per a l'estudi de la hepàtica. Gemma es va obtenir a partir de plantes cultivades esterilitzades i després es va xapar en medi Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) que contenia 1% de sacarosa i 0, 3% de goma gelana i es va incubar a 23 ° C sota llum contínua.
Les cèl·lules BY-2 de tabac (Nicotiana tabacum L. cv. Groc brillant 2) van ser proporcionades per S. Hasezawa (Universitat de Tòquio). Les cèl·lules BY-2 es van diluir 95 vegades en medi Linsmeier i Skoog modificat i es van complementar setmanalment amb àcid 2,4-diclorofenoxiacètic 32 . La suspensió cel·lular es va barrejar en un agitador rotatiu a 130 rpm a 27 ° C a la foscor. Rentar les cèl·lules amb 10 vegades el volum del medi fresc i tornar a suspendre en el mateix medi. Les línies cel·lulars transgèniques BY-2 que expressaven de manera estable el marcador de microtúbuls TagRFP-TUA6 o el marcador de filament d'actina GFP-ABD2 sota el promotor 35S del virus del mosaic de la coliflor es van generar tal com es descriu33,34,35. Aquestes línies cel·lulars es poden mantenir i sincronitzar mitjançant procediments similars als utilitzats per a la línia cel·lular BY-2 original.
Les cèl·lules HeLa es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) complementat amb sèrum boví fetal al 10%, 1, 2 U/ml de penicil·lina i 1, 2 μg/ml d'estreptomicina en una incubadora a 37 ° C amb un 5% de CO2.
Tots els experiments descrits en aquest manuscrit es van realitzar d'acord amb les normatives i directrius de bioseguretat japoneses.
Els compostos es van dissoldre en sulfòxid de dimetil (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) com a solucions stock i es van diluir en medi MS per a Arabidopsis i tabac o en medi Gamborg B5 per a hepàtica. Per a l'assaig d'inhibició del creixement de les arrels, es van sembrar més de 10 llavors per placa en un medi d'agar que contenia els compostos indicats o DMSO. Les llavors es van incubar en una cambra de creixement durant 7 dies. Es van fotografiar les plàntules i es va mesurar la longitud de les arrels. Per a l'assaig de germinació d'Arabidopsis, es van sembrar 48 llavors per placa en un medi d'agar que contenia 200 μM de compost o DMSO. Les llavors d'Arabidopsis es van cultivar en una cambra de creixement i es va comptar el nombre de plàntules germinades 7 dies després de la germinació (dag). Per a l'assaig de germinació del tabac, es van sembrar 24 llavors per placa en un medi d'agar que contenia 200 μM de KAND o DMSO. Les llavors de tabac es van cultivar en una cambra de creixement i es va comptar el nombre de plàntules germinades després de 14 dies. Per a l'assaig d'inhibició del creixement de l'herba hepàtica, es van sembrar 9 embrions de cada placa en un medi d'agar que contenia les concentracions indicades de KAND o DMSO i es van incubar en una cambra de creixement durant 14 dies.
Utilitzeu plàntules tenyides amb 5 mg/ml de iodur de propidi (PI) per visualitzar l'organització del meristema arrel. Els senyals PI es van observar mitjançant microscòpia de fluorescència mitjançant un microscopi d'exploració làser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
La tinció histoquímica de les arrels amb β-glucuronidasa (GUS) es va realitzar segons el protocol descrit per Malami i Benfey36. Les plàntules es van fixar en acetona al 90% durant la nit, es van tacar amb 0, 5 mg/ml d'àcid 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurònic en tampó GUS durant 1 hora i es van col·locar en una solució de cloraldehid hidratat. (8 g d'hidrat de cloral, 2 ml d'aigua i 1 ml de glicerol) i es va observar mitjançant microscòpia de contrast d'interferència diferencial amb un microscopi Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Els angles de les arrels es van mesurar en plàntules de 7 dies cultivades en plaques col·locades verticalment. Mesureu l'angle de l'arrel des de la direcció del vector de gravetat tal com es descriu al pas 6.
La disposició dels microtúbuls corticals es va observar tal com es descriu, amb petites modificacions al protocol 37 . L'anticossos anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) i la IgG anti-ratolí conjugada amb Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) es van utilitzar com a anticossos primaris i secundaris a les dilucions 1:1000 i 1:100, respectivament. Les imatges de fluorescència es van adquirir mitjançant un microscopi d'exploració làser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Adquireix imatges Z-stack i crea projeccions d'intensitat màxima segons les instruccions del fabricant.
L'assaig de proliferació de cèl·lules HeLa es va realitzar mitjançant Cell Counting Kit 8 (Dojindo) segons les instruccions del fabricant.
El creixement d'E. coli DH5α es va analitzar mesurant la densitat cel·lular en cultiu mitjançant un espectrofotòmetre a 600 nm (OD600).
Es va observar l'organització del citoesquelet en cèl·lules transgèniques BY-2 mitjançant un microscopi de fluorescència equipat amb un dispositiu d'exploració confocal CSU-X1 (Yokogawa) i una càmera sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densitat citoesquelètica es va avaluar mitjançant l'anàlisi d'imatges, que va quantificar el percentatge de píxels citoesquelètics entre els píxels citoplasmàtics en imatges confocals mitjançant el programari ImageJ tal com es descriu38,39.
Per detectar la mort cel·lular a les cèl·lules BY-2, es va incubar una alíquota de la suspensió cel·lular amb un 0, 05% de blau d'Evans durant 10 minuts a temperatura ambient. La tinció selectiva de blau d'Evans de cèl·lules mortes depèn de l'extrusió del colorant de les cèl·lules viables per la membrana plasmàtica intacta40. Les cèl·lules tacades es van observar mitjançant un microscopi de camp brillant (BX53, Olympus).
Les cèl·lules HeLa es van cultivar en DMEM complementat amb un 10% de FBS en una incubadora humidificada a 37 ° C i un 5% de CO2. Les cèl·lules es van tractar amb 100 μM KAND 11, àcid kumamonàmic 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) o 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) durant 6 h a 37 ° C. Les cèl·lules es van fixar amb MetOH durant 10 min i després amb acetat durant 5 min a temperatura ambient. Les cèl·lules fixes es van incubar amb anticòs primari β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluït en 0, 5% de BSA/PBS durant 2 hores, es van rentar 3 vegades amb TBST i després es van incubar amb anticòs de cabra Alexa Fluor. 488 1 hora. – IgG de ratolí (Thermo Fisher Scientific: A11001) i 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluït en 0,5% BSA/PBS. Després de rentar-se amb TBST tres vegades, es van observar cèl·lules tacades en un microscopi invertit Nikon Eclipse Ti-E. Les imatges es van capturar amb una càmera CCD refrigerada Hamamatsu ORCA-R2 mitjançant el programari MetaMorph (Molecular Devices).
Hora de publicació: 17-jun-2024